甘薯茎线虫病是影响甘薯生长发育的病害之一，田间受害薯块出现糠心现象，可使发病田块减产20％～50％[1]。该病害在一定程度上限制了甘薯相关产业的发展。近年来，在甘薯生长过程中，针对茎线虫采取了倒茬、清除病残体、生产无病种薯和培育无病壮苗等诸多农业防治措施，但杀虫效果仍有待进一步提高[2]。化学药剂防治是该病害防治的重要手段之一。陈昆圆等[3]研究表明，45%三氟吡啶胺SC对甘薯茎线虫病的触杀活性和盆栽防治效果较好，虫口减退率超过50%。而长期施用化学药剂可能会使线虫产生抗药性，且可能对环境造成一定的污染。微生物杀虫剂具有安全、环保可持续、防治效果好且成本低等优点，成为当前防治甘薯茎线虫病的研究热点之一。
农作物生产不仅要求高产稳产，同时也要求品质优良。在当前生态农业发展背景下，减少化肥施用，采用生态方法促进土壤磷、钾溶解，提高有效磷、有效钾含量，对改善土壤结构，促进作物生长具有重要意义。代志等[4]研究表明，土壤中不仅存在能够抑制和杀死有害生物的生防菌，也存在能够固定氮素，促进土壤中难溶性磷、钾释放的促生菌。孟丽媛等[5]研究指出，按照微生物的作用机理可将其菌肥分为自生固氮菌肥料、解磷细菌肥料、解钾细菌肥料、抗生菌肥料以及复合微生物菌肥。当前研究大多集中在单一菌种的作用或多菌种复合实现菌株多功能化方面，而对于具有多种功能的微生物菌肥研究相对较少。多功能菌种能够有效解决单一菌种稳定性不高，功能单一，以及复合菌剂菌种间的拮抗作用、菌种生存条件存在差异性等问题[6-7]。本研究以生物技术手段分离、筛选出兼具多种功能的菌种并对其进行鉴定，以获得一种应用于甘薯茎线虫病防治的多功能生物制剂（微生物肥），为防治甘薯茎线虫病的微生物菌肥研发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
培养基：解钾菌培养基、解磷菌培养基、阿须贝氏（固氮）培养基、LB液体培养基和LB固体培养基。
种植区甘薯茎线虫发生地自繁的甘薯茎线虫母液（约含有茎线虫1 000条/mL）。
仪器设备：离心机、摇床、显微镜、高压蒸汽灭菌器、细菌培养箱、真菌培养箱、蒸汽消毒器和超净工作台等。
1.2 试验设计
1.2.1 甘薯茎线虫生防菌的初筛
取甘薯茎线虫母液20 mL，加入蒸馏水80 mL，配制成茎线虫200条/mL的悬液，备用。挑取从种植区甘薯茎线虫发生地分离的细菌单菌落，分别编号为HC-6、GS3-X4、GS4-X2、GS2-X5、GS4-X1和GS5-X1，分别置于100 mL LB液体培养基中，在30 ℃摇床、180 r/min条件下培养48 h；取出后将发酵液在离心机10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，再用0.22 µm滤膜过滤，得到发酵液清液，备用。在12孔板中加入500 µL茎线虫悬液（含有甘薯茎线虫100条左右），再加入500 µL的细菌发酵液清液后摇匀；以不含菌液的LB液体培养基为对照，试验设3次重复。12 h后在显微镜下观察，若线虫身体僵直不动，转移到清水中12 h后仍不恢复视为死亡。线虫死亡率与校正死亡率计算如式（1 ）～（2 ）。
死亡率（%）=死亡的线虫数量/线虫总数×100
校正死亡率（%）=（处理组的死亡率-对照组的死亡率）/（1-对照组的死亡率）×100
1.2.2 甘薯茎线虫生防菌的复筛
将初筛细菌菌株分别接入100 mL LB液体培养基中，于37 ℃、160 r/min条件下进行摇瓶培养，用分光光度计检测OD600吸光度，筛选出繁殖速度快的细菌。
1.2.3 遗传稳定性测试
采用划线法将细菌菌株在LB固体培养基平板上进行传代培养，培养10代后，采用12孔平板对峙法测定传代后的菌株对甘薯茎线虫触杀的校正死亡率，以原始菌株对线虫的触杀死亡率为对照（CK）。若该细菌菌株经过10代培养后与原始菌株具有相近的校正死亡率，说明该菌株具有良好的遗传稳定性。各处理重复3次，结果取平均值。
1.2.4 定殖能力测试
将复筛得到的细菌菌株分别接种于LB液体培养基中，30 ℃、160 r/min条件下培养48 h，再将发酵液配制成含菌量1.0 × 109 cfu/mL的菌悬液，备用。将无菌土与固体发酵培养基按4:1的比例均匀混合，装于直径10 cm，高11 cm的花盆中，使混合物的总体积达到150 cm3；浇施200 mL配制好的菌悬液，以淡紫拟青霉（DZ）为对照组，将花盆摆在温室内，控制温度20～28 ℃，每隔4 d浇一次无菌水，15 d后从6 cm处土壤取样1.0 g检测所含有效活菌数，每个菌株5次重复。计算各菌株在每克土中的定殖数量和定殖率，定殖率计算如式（3） 。
定殖率（%）=定殖数量/接种数量×100
1.2.5 解磷、解钾和固氮能力测试
在无菌操作下将低温保存的生防菌分别取一环，在LB固体培养基上划线置于培养箱培养，细菌37 ℃恒温倒置培养2 d，真菌28 ℃恒温倒置培养4 d，备用。用200 μL移液枪在纯化后的菌株平板上打出大小一致的菌饼，备用。将菌饼分别放在解钾菌选择性培养基、解磷菌选择性培养基和阿须贝氏培养基平板上，并做好标记，细菌于37 ℃恒温培养箱中倒置培养5～7 d，真菌于28 ℃恒温培养箱中倒置培养2～5 d。
1.2.6 菌种鉴定
将最终筛选出的细菌菌株在LB固体培养基上划线单独培养，观察菌落形态特征；挑取培养基中的单菌落，经过革兰氏染色后于光学显微镜下观察其颜色和特征，并对其进行NaCl耐受度、甲基红反应等生理生化特征试验；对所筛选的菌株进行16S rDNA基因扩增、测序结果对比，并建立系统进化树。
2 结果与分析
2.1 菌种的筛选
2.1.1 初筛
校正死亡率可以反映细菌或真菌对甘薯茎线虫的触杀效果，对线虫校正死亡率高于70%的菌株视为具有触杀甘薯茎线虫的能力。各拮抗菌对线虫病菌的触杀作用如表1所示，各菌株对线虫的校正死亡率从大到小依次为HC-6（81.5%）、GS4-X2（81.3%）、GS3-X4（79.7%）、GS4-X1（79.5%）、GS5-X1（77.8%）和GS2-X5（77.6%），均具有良好的触杀甘薯茎线虫的能力。
表1 拮抗菌对甘薯茎线虫病菌的触杀作用 (%) |
| 菌株编号 | 校正死亡率 | 菌株编号 | 校正死亡率 |
|---|---|---|---|
| HC-6 | 81.5 | GS2-X5 | 77.6 |
| GS3-X4 | 79.7 | GS4-X1 | 79.5 |
| GS4-X2 | 81.3 | GS5-X1 | 77.8 |
2.1.2 复筛
菌株繁殖速度越快，发酵液生物量越高，吸光度越大。细菌菌株发酵液吸光度检测结果如表2所示，繁殖速度较快的3个细菌菌株为HC-6、GS4-X2和GS5-X1，其吸光度分别为5.48、5.73和4.95。
表2 细菌菌株发酵液的吸光度（OD600）检测结果 |
| 菌株编号 | 吸光度 | 菌株编号 | 吸光度 |
|---|---|---|---|
| HC-6 | 5.48 | GS2-X5 | 4.83 |
| GS3-X4 | 4.72 | GS4-X1 | 4.33 |
| GS4-X2 | 5.73 | GS5-X1 | 4.95 |
2.2 生防菌的性能测试
为充分发挥各菌株的生防功能、促生作用，对复筛获得的3个优良菌株进行了遗传稳定性和定殖能力测试。
2.2.1 遗传稳定性测试
将复筛菌株培养10代，对比传代后的菌株对甘薯茎线虫触杀的校正死亡率与原始菌株（CK）触杀死亡率，以评价菌株的遗传稳定性。由表3可知，GS4-X2对线虫的校正死亡率为81.7%，与原始菌株（82.9%）接近，说明该菌株具有良好的遗传稳定性。
表3 复筛菌株培养10代的遗传稳定性测试结果单位：% |
| 菌株编号 | 传化后菌株 | CK |
|---|---|---|
| HC-6 | 70.8 | 81.8 |
| GS4-X2 | 81.7 | 82.9 |
| GS5-X1 | 74.6 | 78.4 |
2.2.2 定殖能力测试
菌株的定殖率越大，则定殖能力越强。与对照相比，若菌株定殖率低于对照组，则说明其定殖能力较差。由表4可见，细菌菌株GS4-X2、GS5-X1的定殖率分别为138%、133%，均高于对照组；细菌菌株HC-6的定殖率为84%，低于对照组。说明GS4-X2和GS5-X1具有较强的定殖能力。
表4 菌株的定殖率检测结果 |
| 菌株编号 | 接种数量/ （个/g土） | 定殖数量/ （个/g土） | 定殖率/% |
|---|---|---|---|
| DZ | 1.0×108 | 1.25×108 | 125 |
| HC-6 | 1.0×109 | 0.84×109 | 84 |
| GS4-X2 | 1.0×109 | 1.38×109 | 138 |
| GS5-X1 | 1.0×109 | 1.33×109 | 133 |
2.2.3 生防菌解磷、解钾和固氮能力测试
2.3 菌种鉴定与命名
2.3.1 菌落形态
2.3.2 革兰氏染色
GS4-X2的革兰氏染色如图3所示，观察到该菌体为杆状。菌体（1.2～1.5）μm × （2.0～3.0） μm，能运动，有芽孢，革兰氏染色呈阳性。初步认为该菌株属于芽孢杆菌。
2.3.3 菌株的生理生化特征
菌株GS4-X2的生理生化特征见表6。该菌株能在各种碳源培养基中生长，其NaCl耐受度、甲基红反应、接触酶、卵磷脂酶、明胶液化、淀粉水解、阿拉伯糖、溶菌酶抗性、硝酸盐还原以及柠檬酸盐利用均呈阳性，吲哚试验、V-P反应呈阴性。
表6 菌株GS4-X2生理生化特征 |
| 测试项目 | 结果 | 测试项目 | 结果 | |
|---|---|---|---|---|
| NaCl耐受度 | 2% NaCl | ＋ | 甲基红反应 | + |
| 5% NaCl | ＋ | |||
| 7% NaCl | ＋ | |||
| 10% NaCl | ＋ | |||
| 接触酶 | ＋ | 卵磷脂酶 | ＋ | |
| 明胶液化 | ＋ | 吲哚试验 | － | |
| 淀粉水解 | ＋ | 阿拉伯糖 | ＋ | |
| 溶菌酶抗性 | ＋ | 硝酸盐还原 | ＋ | |
| V-P反应 | － | 柠檬酸盐利用 | ＋ | |
|
2.3.4 菌株的16S rDNA测序结果
3 结论与讨论
张雪娇等[6]研究发现，枯草芽孢杆菌B151既能够通过分解秸秆为植株提供养分，又能通过与病原菌的拮抗作用实现病害预防。本试验筛选得到的贝莱斯芽孢杆菌HM-6作用与之类似，既能够实现线虫病的防治，也能够通过解磷、解钾和固氮起到促生作用。
本研究以生物技术手段筛选出兼具多种功能的菌种并对其进行鉴定。筛选出具有触杀甘薯茎线虫能力强，解磷、解钾和固氮能力强，且无拮抗作用的GS4-X2菌株，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌菌株，命名HM-6。该菌株可作为研发防治甘薯茎线虫病微生物菌肥的材料,对于甘薯稳定生产具有重要意义。