花生是一种重要的油料和经济作物，是富含油脂和挥发油类的能源植物之一。近年来花生种植面积逐年扩大，产量也随之提高[1]。姚珍珠等[2]研究表明，花生主要种植在干旱、半干旱地区，地域降水量偏少或季节性干旱，可能使花生在不同生育阶段受到干旱胁迫的影响。干旱是影响花生生产种植的因素之一。随着气候变化加剧，干旱胁迫发生的频率和影响面积不断增加，最终会影响农业生产。
根系为植物提供了强大的固着和支持作用，同时又负责吸收水分、矿物质和储存营养物质等。根系的生长状况与活力可能影响作物的生长发育和产量。谷娇娇等[3]研究表明，盐胁迫会导致水稻的根系总长度、体积、表面积、根系活力和根干重下降，最终影响水稻产量；程贝等[4]研究表明，0.2%和0.3%的盐浓度胁迫导致番茄幼苗根系干质量和根系形态参数下降；徐芬芬等[5]研究表明，高浓度铝胁迫降低了花生根系超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性，增大其根系细胞质膜透性；鲁晓峰等[6]研究表明，外源酚酸处理导致草莓根系活力明显下降，影响其根系总根长、表面积、体积和平均直径。可见，逆境胁迫会影响根的生长发育。
线粒体作为细胞内最先识别逆境胁迫的部位之一，其在维持非生物胁迫下细胞的正常生命活动中发挥不可或缺的作用[7]。线粒体呼吸系统可以通过调节细胞内氧化还原反应平衡调控胁迫对植物的伤害[8-9]，还可以将应激感知转化为能量缺乏信号，然后重新建立代谢平衡[10]。植物受到胁迫后，呼吸和光合通量发生变化，产生能量亏缺信号，从而导致细胞器和核基因表达的全局变化[11]。因此，研究线粒体在逆境胁迫下相关基因的表达变化有助于了解逆境胁迫下线粒体的响应机制。
花生遭遇脱水胁迫时，会发生一系列的生理反应，调节自身生长状态以提高自身抗旱性。目前在花生对于脱水胁迫的响应、抗旱性鉴定方法和抗旱相关基因定位、克隆等方面已有相关报道，而花生根系遭遇脱水胁迫时其内部线粒体功能的响应机制有待深入探究。因此，本试验对花生幼苗进行脱水处理，观察其根系状态，测定其根系总长度、体积和表面积等形态指标，对根尖细胞进行染色，测定根尖腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine 5’-triphosphate，ATP）含量和线粒体相关基因的表达变化，为进一步分析脱水胁迫对花生根系线粒体功能的影响提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料处理
选取饱满均匀的花生种子浸泡萌发，在光照培养箱（28 ℃，光周期16 L∶8 D）中利用MS培养液培养至二叶期。挑选长势相同的二叶期花生幼苗，从培养液中取出，脱水8 h作脱水材料。
1.2 测定项目与方法
1.2.1 根系形态指标测定
利用植物根系分析系统LD-GX01（山东莱恩德智能科技有限公司）对花生根系进行扫描，利用根系分析软件WinRHIZO测定根系总长度、体积、表面积和平均直径。
1.2.2 根系相对含水量测定
将花生根系剪碎混匀，称取重量为鲜重，放入105 ℃烘箱中杀青0.5 h，随后50 ℃烘干至恒重，称取重量为干重。相对含水量计算如式（1） 。
相对含水量（%）=（鲜重－干重）/鲜重×100
1.2.3 根尖死亡细胞检测
将花生根尖放入0.4%的台盼蓝染料中，置于室温下染色15 min，然后用清水清洗5次后观察拍照，各处理染色进行10个重复。
1.2.4 根尖ATP含量测定
利用ATP含量检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）测定花生根尖ATP含量。称取0.1 g花生根尖材料，加入1 mL提取液，进行冰浴混匀，8 000 r/min， 4 ℃离心10 min。将上清液转移至另一离心管中，加入500 µL氯仿充分震荡混匀，10 000 r/min， 4 ℃离心3 min，取上清液用分光光度计测定700 nm处吸光度值。
1.2.5 基因表达分析
采取Trizol方法提取花生RNA，使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒进行反转录。以cDNA为模板，用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京诺维赞生物科技股份有限公司）的反应体系，利用ABI QuantStudio™ 6 Flex（Applied Biosystems）实时荧光定量PCR系统检测基因表达变化。以花生UBI2为内参，通过2- ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量，每个样品进行3次重复，取平均值。引物序列如表1所示。
表1 引物序列 |
| 引物名称 | 序列（5’—3’） |
|---|---|
| UBI2 | F：AAGCCGAAGAAGATCAAGCAC |
| R：GGTTAGCCATGAAGGTTCCAT | |
| arahy.0LX666 | F：ATTGCCCTTCTTCACTCACGCGATA |
| R：GCTGTTTGATGAGCCTGCGTAGTAT | |
| arahy.I2EFRY | F：ACCATAGGAGGACTCACTGGAATAG |
| R：ATGCTGCCACGGTAATGAGGA | |
| arahy.8GMV2Y | F：AGCCCTGCTTTGGTCTCTGGTTTGA |
| R：GAACTACTGGGAAGATCATAGCGGA | |
| arahy.AJMC4E | F：CCTAACGGGAATGAGCAAGAACGAA |
| R：CAAGCCCGATTTCAGGTTCAGG |
1.3 数据处理
利用Excel 2010软件对数据进行统计分析，使用GraphPad Prism 9.0软件作图。
2 结果与分析
2.1 根系形态参数变化
2.2 根尖细胞台盼蓝染色
为探究脱水胁迫导致花生根系生长受抑制的部位，对花生根尖细胞进行台盼蓝染色，结果如图3所示，对照的花生幼苗根尖没有出现细胞被染色，脱水胁迫后的花生根尖被完全染色。表明脱水胁迫会引起花生根尖细胞大量死亡，导致根系生长受抑制。
2.3 根尖ATP含量测定
植物的各项生命活动，包括根系生长发育都需要能量。由图4可知，脱水胁迫的花生根尖的ATP含量为1.29 μM/DW，较对照降低83.92%，差异具有统计学意义（P<0.05）。表明脱水后的根尖ATP含量明显降低，推测脱水胁迫可能影响花生根尖细胞的能量代谢，从而导致其死亡。
2.4 根系线粒体相关基因表达分析
ATP合酶是利用跨膜质子泵催化ADP和磷酸反应生成ATP的一类蛋白复合体。对花生ATP合酶α亚基基因（arahy.0LX666）、编码细胞色素C氧化酶亚基基因（arahy.I2EFRY）、编码NADH-泛醌氧化还原酶（arahy.8GMV2Y）和编码CcmFC蛋白基因（arahy.AJMC4E）进行表达量测定，结果如图5所示，脱水胁迫后4个基因的表达均明显降低，与对照差异具有统计学意义（P<0.05）。脱水胁迫后，arahy.0LX666相对表达量降低，可能是ATP合酶亚基在脱水胁迫下受到损伤，进而导致花生根细胞ATP含量下降；arahy.I2EFRY、arahy.8GMV2Y和arahy.AJMC4E相对表达量降低，推测是脱水胁迫下花生根尖细胞线粒体功能出现障碍，ATP合成受阻、含量下降，从而抑制了花生根系的生长。
3 结论与讨论
所有生物体维持生命活动都需要能量的供应。植物细胞中的能量转换器是叶绿体和线粒体。植物根细胞中没有叶绿体，因此线粒体是进行能量生产的主要场所。细胞有氧呼吸的第二阶段和第三阶段，即三羧酸循环与氧化磷酸化分别在线粒体基质和内膜上发生，通过分解碳水化合物产生ATP以满足细胞各种代谢过程的能量需求[12]。
王桢珍等[13]研究表明，干旱胁迫抑制了2种藤本植物的气生根生长，在干旱无支持物处理中表现出最小的气根长度和数量。李冠军等[14]研究表明，土壤盐胁迫下，木麻黄幼苗根系活力、根系总长、总根表面积、总根体积和总根直径均降低。本研究结果与此基本一致。植物在遭受非生物胁迫时，线粒体作为一个对环境变化较为敏感的细胞器，其结构和功能可能会受到影响。金天等[15]研究表明，缺硼处理降低了线粒体膜流动性、线粒体膜电位和细胞色素c/a值，缺硼明显抑制枳幼苗的生长发育，其作用机制可能与线粒体结构与功能受损有关；卫星等[16]研究表明，干旱胁迫后，水曲柳苗木细根线粒体数量减少，分布密度降低，结构遭受破坏，导致线粒体呼吸功能受阻。本研究表明，脱水胁迫导致花生根系线粒体能量生产受到抑制，ATP含量降低。
线粒体ATP合酶的活力与植物对胁迫的耐受性有关[17]。Moghadam等[18]研究表明，MtATP6是编码ATP合酶亚基的基因，逆境胁迫下的耐盐小麦品种中MtATP6表达的程度和时间均高于敏盐品种。Zhang等[19]研究表明，过表达 RMtATP6基因的转基因烟草在幼苗期比未转化烟草对盐胁迫的耐受性更强。本试验发现脱水胁迫下，花生ATP合酶亚基基因（arahy.0LX666）表达量明显下调，推测ATP合酶活力下降，导致能量生产不足，根细胞死亡。除了ATP合酶之外，肖长运[20]研究指出，双酚A暴露下，大豆根细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶和细胞色素C氧化酶的活性均受到干扰，引起线粒体能量生产功能障碍，导致ATP合成减少，根尖细胞生长受阻。
综上，脱水胁迫的花生根系的相对含水量、总长度和体积等均明显降低，根尖ATP含量较对照也出现下降，脱水胁迫后的线粒体相关基因表达受到干扰，推测遭受胁迫后根尖线粒体能量生产功能发生障碍，可能导致根系生长受阻。研究为进一步分析脱水胁迫对花生根系线粒体功能的影响提供参考。