冷加工蛋糕因其特殊的生产工艺、优质的品质，获得了较多消费者的喜爱。然而，其含水量较高、营养成分丰富，在加工及储存过程中易受到微生物污染，造成菌落总数超标，导致产品腐败无法食用[1-2]。因此，控制微生物生长繁殖，对于提高冷加工蛋糕的品质、延长货架期极其重要。
食品防腐剂是一类可以杀灭或抑制细菌生长的物质，按照其组分和来源可以分为天然和人工化学合成两大类[3]。随着对食品添加剂的管理要求不断提高，天然防腐剂因其天然、安全和环保等特点以及良好的抑菌效果受到生产企业的青睐以及消费者的认可，被广泛应用[4]。纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸是常见的天然防腐剂，在食品加工中发挥重要作用。如张祖丽等[5]发现，纳他霉素能够较好地抑制食品中的酵母菌和霉菌，对细菌和病毒抑制效果不明显。吕淑霞等[6]研究发现，乳酸链球菌素对造成食品腐败的革兰氏阳性菌具有一定的抑制作用。赵昇等[7]研究表明，ε-聚赖氨酸对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及部分真菌有一定的抑制效果。目前天然抑菌剂在冷加工蛋糕中的应用研究处于探索阶段。基于此，本文通过平板计数法研究纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸3种天然抑菌剂及其复配对冷加工蛋糕中菌落总数的抑制效果，并采用正交试验确定各因素水平的最佳配比，为提高冷加工蛋糕品质和延长货架期提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
样品购自当地糕点零售店；纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸，购自上海源叶生物科技有限公司；无菌生理盐水和平板计数琼脂，购自北京陆桥技术股份有限公司。
1.2 设备与仪器
试验设备与仪器包括BagMixer 40型拍击式均质器（法国Interscience）、移液器 Eppendorf research plus（德国Eppendorf公司）、MSC 1.8型生物安全柜（赛默飞世尔科技有限公司）和恒温培养箱（德国Binder公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 天然抑菌剂的配制
准确称取一定量的纳他霉素、乳酸链球菌素和ε-聚赖氨酸，其中乳酸链球菌素、纳他霉素配制成质量浓度依次为1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g/L的悬浮液，ε-聚赖氨酸配制成质量浓度依次为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/L的悬浮液。
1.3.2 单一天然抑菌剂的抑制试验
称取冷加工蛋糕25.0 g，加入225 mL无菌生理盐水制成1∶10稀释液，吸取稀释液9 mL到15 mL无菌离心管中，分别加入上述配制好的不同种类和浓度的天然抑菌剂1 mL，以未添加天然抑菌剂的试样为对照。置于36 ℃恒温培养箱中培养，培养24、36和48 h时分别进行无菌取样，吸取培养液1 mL至无菌培养皿中。
1.3.3 天然抑菌剂复合正交试验
依据单因素试验的结果，设置复配天然抑菌剂的浓度，以纳他霉素（A）、乳酸链球菌素（B）和ε-聚赖氨酸（C）为因素，以无菌生理盐水为空白对照，采用3因素3水平设计正交试验（表1），培养时间设为48 h。
表1 正交试验因素与水平单位：（g/L） |
| 水平 因素 | A纳他霉素添加量 | B乳酸链球菌素添加量 | C ε-聚赖氨酸添加量 |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.22 | 0.22 | 0.12 |
| 2 | 0.26 | 0.26 | 0.16 |
| 3 | 0.30 | 0.30 | 0.20 |
1.4 测定指标
取样后按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法进行培养并计数，每次做2个重复，计数结果取平均值，计算抑菌率如式（1） 。
抑菌率（%）=（对照组样品菌落总数－处理组菌落总数）÷对照组样品菌落总数×100
1.5 数据处理
采用Excel软件进行数据分析与作图。
2 结果与分析
2.1 单一抑菌剂的抑菌效果
2.1.1 纳他霉素
由图1可知，在冷加工糕点的培养过程中，纳他霉素处理后样品的抑菌率在培养24和36 h后变化较小，且随着浓度的增加变化相对平缓。在培养48 h后，抑菌率较24和36 h有明显的下降，这可能是因为纳他霉素对真菌的生长有较强的抑制作用，随着培养时间的延长，培养液中细菌逐渐成为优势菌群，从而导致纳他霉素抑菌效果下降明显。
2.1.2 乳酸链球菌素
由图2可知，在冷加工糕点的培养过程中，样品抑菌率在培养24和36 h后变化不大，随着浓度的增加变化相对平缓，结果与纳他霉素处理后的变化规律相似。在培养48 h后，当乳酸链球菌素浓度达到0.3 g/L，抑制率较0.2 g/L浓度时有较大的提升。表明乳酸链球菌素浓度高于0.3 g/L时有着更好的抑菌效果。
2.1.3 ε-聚赖氨酸
2.2 正交试验
由表2可知，各因素对样品菌落总数影响的主次顺序为ε-聚赖氨酸>乳酸链球菌素>纳他霉素。9个处理组合中，抑菌效果最好的组合为A1B2C3，即纳他霉素0.22 g/L、乳酸链球菌素0.26 g/L和ε-聚赖氨酸0.20 g/L，抑苗率91.15%。由K值确定的各因素的理论最优组合为A1B2C1，即纳他霉素0.22 g/L、乳酸链球菌素0.26 g/L和ε-聚赖氨酸0.12 g/L。
表2 正交试验结果 |
| 试验编号 | A 纳他霉素/（g/L） | B 乳酸链球菌素/（g/L） | C ε-聚赖氨酸/（g/L） | 抑菌率/% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.22 | 0.22 | 0.12 | 82.12 |
| 2 | 0.22 | 0.26 | 0.20 | 91.15 |
| 3 | 0.22 | 0.30 | 0.16 | 72.83 |
| 4 | 0.26 | 0.22 | 0.20 | 68.57 |
| 5 | 0.26 | 0.26 | 0.16 | 69.24 |
| 6 | 0.26 | 0.30 | 0.12 | 85.28 |
| 7 | 0.30 | 0.22 | 0.16 | 66.89 |
| 8 | 0.30 | 0.26 | 0.12 | 88.53 |
| 9 | 0.30 | 0.30 | 0.20 | 90.09 |
| K1 | 82.03 | 72.53 | 85.31 | |
| K2 | 74.36 | 82.97 | 69.65 | |
| K3 | 81.84 | 82.73 | 83.27 | |
| 极差 | 7.67 | 10.44 | 15.66 |
3 结论与讨论
李新等[8]研究乳酸链球菌素、溶菌酶、迷迭香提取物和纳他霉素4种天然抑菌剂对哈尔滨红肠贮藏期品质的影响，发现随着贮藏时间的延长，红肠的菌落总数呈上升趋势。本研究结果表明，随着培养时间的延长，抑菌剂的抑菌率逐渐下降，即冷加工蛋糕中菌落总数呈上升趋势，与上述研究结果相似。吴臻仪等[9]研究复配保鲜剂对葡萄的保鲜效果，发现防腐保鲜剂对样品菌落总数影响的主次顺序为水杨酸>纳他霉素>溶菌酶>乳酸链球菌素；吴彦莹等[10]通过单因素试验表明，各防腐剂抑菌效果的重要性为壳聚糖>乳酸链球菌素>纳他霉素。本研究发现，各抑菌剂的对样品菌落总数影响的主次顺序为ε-聚赖氨酸>乳酸链球菌素>纳他霉素。与相关研究结果有所区别，原因可能是葡萄和饮料与蛋糕的品种特点存在差异。与ε-聚赖氨酸相比，乳酸链球菌素和纳他霉素的抑菌率明显较低，表现出较弱的抑菌效果，这可能与纳他霉素对真菌抑制能力较强、乳酸链球菌素对部分细菌的抑制效果有限相关[11]。不同天然抑菌剂的抑菌机理不同，由于冷加工蛋糕中微生物体系较为复杂，单一天然抑菌剂的抑菌范围及能力有限，且某些抑菌剂的活性和稳定性易受到冷加工蛋糕加工环境和基质的影响，使用复配抑菌剂往往能发挥其协同增效作用，更好地延长冷加工蛋糕的货架期。
本试验通过测定和不同浓度的ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素处理不同时间对冷加工蛋糕抑菌率的影响，并通过正交试验筛选出抑菌效果最优的组合。发现ε-聚赖氨酸、乳酸链球菌素和纳他霉素均有一定的抑菌作用，其理论最佳抑菌组合为纳他霉素0.22 g/L、乳酸链球菌素0.26 g/L和ε-聚赖氨酸0.12 g/L。试验表明天然复配抑菌剂具有广阔的应用前景，对延长冷加工蛋糕的货架期具有一定的指导意义。