树莓属蔷薇科（Rosaceae）悬钩子属（Rubus）植物，因其果实口感酸甜，风味独特，且富含维生素、抗氧化物等营养物质，是一种广受消费者喜爱的药食同源水果，被广泛应用于医药、食品等领域[1-2]。其野生资源十分丰富，以云贵川地区较为集中[3]，市场上需求量大，发展前景较为广阔。目前其品种选育研究还有待加强。杂交育种是新品种选育的重要手段之一，代汉萍等[4]对8个树莓品种进行无刺杂交试验，发现其近交系和杂种后代的刺密度遗传表现差异显著，后代的刺密度变异系数较高，可通过杂交育种培育无刺品种。花粉活力、花期不遇等自然因素直接影响着授粉的成功率。莫周美等[5]通过测定葛根不同花蕾期（半伸期、始开期、半开期和盛开期）的花粉活力，发现葛根花在始开期至盛开期为最佳杂交授粉时间，花粉活力可维持较高水平，此时授粉效率较高。焦雪辉等[6]研究11个紫薇品种的柱头可授性日变化规律，得出在11：00—12：00，柱头可授性最强，其他时间柱头可授性相对较弱。目前，对树莓的研究主要集中在栽培技术、资源调查、果实营养成分分析、引种推广及种质评价等方面[7-9]。为探索树莓花粉最佳采集、去雄和授粉时期，筛选适宜的花粉干燥方法，本研究观测了大红泡、黑莓和掌叶覆盆子3个树莓品种花粉的不同发育时期、日变化的花粉活力及不同发育时期柱头可授性变化规律，同时探寻花粉含水量与贮藏条件的关系，为今后开展树莓杂交育种研究和种质资源的创新提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以适应良好、选择应用较广的树莓品种大红泡、黑莓和掌叶覆盆子为供试材料，均种植于贵州省植物园悬钩子属资源圃，种植地长×宽为0.5 m×0.5 m，进行日常养护管理。
TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）（分析纯，福州飞净生物科技有限公司）、过氧化氢（分析纯，上海麦克林生化科技股份公司）；联苯胺（分析纯、上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 不同发育时期对花粉活力和柱头可授性的影响
将树莓花朵发育分成4个时期，如图1所示。每个发育时期的花各取9朵进行花粉活力和柱头可授性检测，以确定树莓最佳采粉时期。
1.2.2 不同时段对花粉活力的影响
在测定不同品种树莓最佳采粉时期后，分别在最佳采粉时期测定一天内不同时段的花粉活力（8：30、10：30、12：30、14：30和16：30），分析其花粉活力的日变化规律，以确定树莓花粉的最佳采粉时间。
1.2.3 不同干燥方式对花粉含水量和活力的影响
在上述试验筛选出的最佳采粉时期内，每个品种采集15朵，迅速带回实验室收集花粉。每种树莓花粉分成3份，分别采用室内通风自然干燥法和硅胶干燥法进行干燥处理，对干燥完成后的样品进行花粉活力测定。室内通风自然干燥法是将花粉平铺于硫酸纸上，置于室内通风处自然干燥24 h。硅胶干燥法是将花粉置于硅胶干燥器中干燥8和24 h。
1.2.4 不同含水量及低温对花粉贮藏的影响
将干燥完成的树莓花粉分装于1.5 mL离心管中，用医用注射器抽真空，分别在低温（4 ℃）及低温冷冻（-20 ℃）2种条件下贮藏，每隔5 d测定各个贮藏条件下的花粉活力。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 花粉活力
试验采用TTC法测定花粉活力。采集新鲜花粉（花苞略有松动），滴入1~2滴0.5% TTC溶液置于花粉样品中，搅匀后迅速盖上盖片，放入湿润培养皿中，置于37 ℃黑暗条件下，30 min后在40倍光学显微镜下观察染色结果。每个品种观察3个载玻片，每片取3个不重叠视野，每个视野花粉粒总数不少于20粒。若花粉变红则表明有活力，若红色很浅或无变化则表明无活力。一个视野下的花粉活力计算如式（1） 。
花粉活力（%）＝红色花粉数/花粉总数×100
1.3.2 柱头可授性
采用联苯胺—过氧化氢法测定柱头可授性。染色液的配制比（体积比）为1%联苯胺∶3%过氧化氢∶水＝4∶11∶22。用镊子将采集的柱头取下，浸入染色液中，立即置于显微镜下观察，若柱头具可授性，则柱头周围的反应液呈现蓝色并有大量气泡出现。每个品种随机取3朵花的柱头进行测定，重复3次。检测结果及分级标准见表1。
表1 柱头可授性检测结果及分级标准 |
| 柱头可授性 | 颜色变化 | 气泡 | 分级 |
|---|---|---|---|
| 无 | 不变色 | 无 | 0 |
| 轻微 | 呈轻微变色 | 几个 | 1 |
| 低 | 呈浅蓝色 | 较少 | 2 |
| 较低 | 呈浅蓝色 | 较多 | 3 |
| 高 | 呈蓝色 | 大量连续小 | 4 |
| 较强 | 呈深蓝色 | 连续大 | 5 |
1.3.3 花粉含水量
采用差减法测定花粉含水量。先将称量瓶放入120 ℃烘箱中烘干至恒重，置于干燥器中冷却后称重（W 1）；然后将一定量花粉加入称量瓶中称重（W 2）；置于120 ℃烘箱中烘干至恒重，冷却后称重（W 3）；重复3次，取平均值，含水量计算如式（2） 。
花粉含水量（%）=（W 2-W 3）/（W 2-W 1）×100
1.4 数据处理
采用Excel软件对数据进行统计和图表制作。
2 结果与分析
2.1 不同发育时期花粉活力和柱头可授性的变化
2.1.1 花粉活力
由图2可知，随着花朵的发育，各个花期的花粉活力发生明显变化。从花期Ⅰ至Ⅳ，大红泡和黑莓的花粉活力变化趋势均为先增加后降低，在花期Ⅲ花粉活力达到最大。掌叶覆盆子随着花朵发育的进程，其花粉活力呈逐渐增加趋势，在花期Ⅳ花粉活力达到最高。说明大红泡和黑莓的最佳采粉时期是花期Ⅲ，掌叶覆盆子最佳采粉时期是花期Ⅳ。
2.1.2 柱头可授性
2.2 不同时段花粉活力变化
由图4可知，3种树莓花粉活力的日变化较大。大红泡、黑莓和掌叶覆盆子在正午时间花粉活力有所下降，随着时间的推移，花粉活力又随之上升。大红泡、掌叶覆盆子花粉活力最高值出现在14：30，分别为82.33%和98.37%，黑莓花粉活力最高值出现在16：30，花粉活力达到98.48%。说明树莓最佳采粉时间段是12：30—14：30，其次时间段是8：30—10：30。
2.3 不同干燥方式花粉含水量和活力的变化
由表2可知，树莓花粉经过3种干燥方法处理后花粉的含水量和活力变化有所差异。随干燥程度的加深和干燥时间的延长，花粉含水量明显下降，而花粉活力的变化则呈现相反趋势。其中硅胶干燥24 h处理的花粉活力最高，大红泡、黑莓和掌叶覆盆子的花粉活力分别为83.33%、87.33%和83.00%；含水量分别为20.59%、14.67%和15.36%。说明硅胶干燥24 h处理能较好保持树莓花粉活力，硅胶干燥8 h处理次之。
表2 不同干燥方式对花粉含水量和活力的影响 (%) |
| 品种名 | 干燥方式 | 花粉相对含水量 | 花粉活力 |
|---|---|---|---|
| 大红泡 | 室内通风自然干燥24 h | 79.36 | 44.00 |
| 硅胶干燥法8 h | 30.76 | 57.67 | |
| 硅胶干燥法24 h | 20.59 | 83.33 | |
| 黑莓 | 室内通风自然干燥24 h | 71.47 | 26.67 |
| 硅胶干燥法8 h | 22.56 | 59.00 | |
| 硅胶干燥法24 h | 14.67 | 87.33 | |
| 掌叶覆盆子 | 室内通风自然干燥24 h | 73.35 | 27.67 |
| 硅胶干燥法8 h | 25.33 | 43.33 | |
| 硅胶干燥法24 h | 15.36 | 83.00 |
2.4 不同含水量花粉的低温贮藏特性
将大红泡、黑莓和掌叶覆盆子3种树莓花粉分别贮藏在4 ℃和-20 ℃的低温条件下，其花粉活力的变化情况如图5~10所示。在花粉含水量相同的情况下，3种树莓的花粉活力变化在低温条件下基本一致，均随贮藏时间推移而逐渐降低，但与4 ℃贮藏相比，在-20 ℃贮藏条件下花粉的贮藏期限明显延长，花粉活力下降速度较慢。如图5~6所示，在4 ℃贮藏条件下，含水量为30.76%和20.59%的大红泡花粉在贮存30 d后其花粉活力分别为2.33%和50.33%；随着贮藏时间的延长，含水量为20.59%的大红泡花粉逐渐失活，花粉最长能贮存90 d。在-20 ℃贮藏条件下，含水量为30.76%和20.59%的大红泡花粉在贮存30 d后其花粉活力分别为10.33%和55.66%；贮存90 d后，含水量为20.59%的大红泡花粉活力仍能达到11.00%。在低温条件下黑莓、掌叶覆盆子的花粉活力也随花粉含水量的降低表现出花粉贮藏时间延长的趋势。由此可见，花粉含水量和贮藏温度是影响花粉贮藏时间的重要因素。
3 结论与讨论
柱头可授性的强弱直接影响杂交结实率，确定最佳去雄及授粉时期有助于建立高效的杂交或自交技术。本研究结果表明，树莓在花期Ⅲ时花粉活力较高，柱头可授性较强；另外，花期Ⅰ和Ⅱ的花粉囊未打开，柱头上未附着花粉且花粉生活力较低。因此，树莓的最佳授粉期为花期Ⅲ，最佳花粉采集期为花期Ⅲ，最佳去雄期为花期Ⅰ和Ⅱ。以上措施避免了杂交授粉中可能出现同种或外源花粉粒污染，增加授粉的可信度，使得花粉粒和柱头处于成熟的生理状态下，提高杂交授粉的成功率。
在自然条件下，大部分植物的花粉保存时间的长短受贮藏温度和花粉本身含水量的影响[11-13]。李玉领等[12]研究表明,在4和-20 ℃贮藏条件下，可减缓葡萄花粉活力的下降速度。低温可抑制花粉内部物质的代谢，降低酶活性，从而延缓花粉的衰老[14-16]。未经干燥处理的花粉在低温冷冻保存的过程中容易造成细胞膜受损，而花粉含水量过低又会导致花粉活力下降，导致低温保存后的花粉活力更低或保存时间缩短[17]。因此，适度降低花粉含水量有利于保持花粉活力。本研究发现，硅胶干燥剂处理24 h后再进行低温贮藏，能有效保持花粉活力。4和-20 ℃贮藏条件适于树莓花粉短期贮藏，且-20 ℃贮藏条件下树莓花粉的耐贮藏能力较好，说明贮藏温度是影响树莓花粉寿命的重要因素之一，且贮藏温度越低，花粉的贮藏时间越长。因此，花粉贮藏时应选择合适的贮藏温度和花粉含水量，但各个温度条件下花粉贮藏的最适含水量研究较少，干燥程度不确定，无法大幅度提高花粉的贮藏时间，明确花粉干燥程度或含水量是下一步需要解决的问题。同时，花粉的超低温保存技术日渐兴起，这也是花粉活力贮藏研究的一个重要内容，尚需进一步研究。
综上，本研究通过比较大红泡、黑莓和掌叶覆盆子3种树莓品种的花粉活力及贮藏条件，综合分析花粉活力和柱头可授性等指标，结果表明，树莓最佳花粉采集期为花期Ⅲ，杂交的最佳授粉时期为花期Ⅲ，最佳去雄期为花期Ⅰ和Ⅱ，最佳采粉时间段是12：30—14：30；采用硅胶干燥24 h方法进行干燥，其花粉活力保存较佳；-20 ℃贮藏条件下树莓花粉的耐贮藏能力较好。其中有关花粉干燥程度或含水量对花粉贮藏时间的影响有待进一步研究。