中国有悠久的山羊养殖历史，养殖数量和品种多样性均较高，随着城乡居民收入水平的不断提高，国内人均羊肉消费量持续增长。然而，在山羊养殖方面存在许多问题，如小规模分散养殖、养殖技术和品种性能有待提高，以及疾病防治能力有待加强等。精液冷冻保存技术的发展对于遗传资源的长期保存和优良品种的快速繁殖具有重要意义。改善山羊精液冷冻保存技术对于提高优良种公羊利用率、扩大遗传影响范围至关重要。然而，山羊精液对冷冻保存的敏感性较高，冷冻过程中易受到损伤，导致解冻后的精子活力下降。因此，研究有效的冷冻保护剂对于提高山羊精液冷冻保存效果具有重要意义。目前，许多学者对精液冷冻保存技术进行了深入研究。这些研究主要集中在开发新型稀释剂、优化冷冻程序以及探索植物源性保护剂等方面。Ugur等[1]指出，改进冷冻保护程序，开发新型拓展剂可以有效减少公牛精液冷冻后的细胞损伤，提高解冻后的精子质量，证明了优化冷冻过程对于提高精子质量具有重要作用。Zhang等[2]研究了过量活性氧（Reactive oxygen species，ROS）引起的氧化应激对奶山羊精液的影响，并通过添加黄芪多糖来改善精液冷冻保存效果，结果表明，0.2 g/L黄芪多糖处理能有效提高精子线粒体膜电位和三磷酸腺苷含量，并通过调节凋亡相关蛋白降低了精子的凋亡率。针对奶山羊精浆中含有磷脂酶和卵黄凝集酶的情况，Zou等[3]利用牛精浆代替奶山羊精浆进行山羊精液冷冻保存，结果显示，牛精浆加用牛稀释液，可以提高奶山羊精子的冷冻质量。这些研究证明了选择替代性冷冻保护剂的重要性。已有大量研究致力于改善精液冷冻保存技术，但在冷冻保护剂开发与应用方面仍存在较多不足。因此，本文综述了大豆卵磷脂（Soybean lecithin，SL）和低密度脂蛋白（Low-density lipoprotein，LDL）在山羊精液冷冻保存中的应用效果及其作用机理，为进一步提高山羊精液冷冻保存技术提供参考。
1 山羊精液冷冻保存技术
山羊精液冷冻保存技术是指通过使用氮气构建极低温环境使山羊精液中的精子生理活动处于静止状态。在母山羊发情需要交配时，将储存的精子解冻，使其恢复正常活力，并通过人工授精的方式将精子注射入母羊体内，确保母山羊能够正常受孕[4]。但山羊精子在冷冻—解冻过程中会受到氧化应激、冷应激等不利因素带来的损伤，导致精子解冻后质量较低，限制了山羊冻精的应用。此外，山羊精液冷冻保存效果也受精液的稀释比、冷冻保护剂类型、抗氧化剂和稀释剂种类等影响[5]。稀释液的稀释倍数对山羊精液的受胎率有显著影响，刘孝德等[6]研究表明，山羊精液常温稀释液的稀释倍数比为1∶10（v∶v）和1∶50（v∶v）时，母羊的第一情期受胎率最高。一般用于精液冷冻保存的扩展剂含有冷冻保护剂（如甘油或卵黄）[7]、维持渗透压的物质[8]、能量来源（如葡萄糖或果糖）以及酶和抗生素等[9]。目前，山羊精液冷冻保存稀释液中通常使用Tris作为缓冲液，并在其中添加无机盐（如柠檬酸钠，柠檬酸）、糖类（如葡萄糖，果糖和乳糖）、冷冻保护剂（如卵黄和甘油）以及抗氧化剂等物质。这些物质在冷却、冷冻和解冻期间对于维持精子的活力至关重要，而各物质的添加量也会对精液冷冻造成较大影响[10]。近年来大量研究对部分传统配制原料进行代替或补充，Thiangthientham等[11]评估了用芝麻油替代卵黄对山羊精子质量的影响，结果表明，8.75%卵黄和1.25%芝麻油组成的稀释剂相比于10%卵黄，其保存的精子质量更高。Alcay等[12]研究表明，将8%虹鳟精浆添加进基于卵磷脂的补充剂中，对山羊精子保存具有有益的作用。
2 山羊精液冷冻保存中的冷冻损伤
在精液冷冻保存和升温解冻过程中，精子细胞因外界环境变化而受到一定的损伤，再加上山羊精子质膜较薄，抗冷打击能力较弱，其在低温环境下容易受损，导致冷冻保存效果不佳[13]。在冷冻过程中，精子细胞外的水会形成冰晶，导致细胞外溶液浓度升高，细胞脱水，细胞内溶质浓度增加，冰点降低，从而损伤精子细胞；另一方面，形成的冰晶可能会刺破精子细胞膜，损害其正常生理功能[14]。山羊精子细胞含有大量的多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid， PUFA），这使得精子膜更容易受到ROS引起的氧化损伤[15]。另外，在精液冷冻保存过程中，精子因遭受冷打击，可能导致ROS过量积累并与精子质膜发生脂质过氧化反应，造成精子活力降低、线粒体功能受损、质膜完整性破坏和精子凋亡，使精子丧失正常的生理功能和授精能力[16]。
3 山羊精液冷冻保存中冷冻保护剂的应用
精液冷冻保护剂在精子冷冻保存中起着至关重要的作用，其可以有效降低极低温环境对精子的损伤，保证精子在解冻后仍能保持正常活力。精液冷冻保护剂可以分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂[17]。渗透性保护剂的作用是降低冰核温度和缩小冰晶尺寸，渗入精子细胞内部，提高精子细胞内的溶液浓度，从而防止精子细胞因严重脱水而受损[18]。常见的渗透性保护剂包括甘油、乙二醇等，但其具有一定毒性，某些试剂渗透到精子细胞内部，易造成细胞损伤[19]，因此需要使用非渗透性冷冻保护剂来保护冷冻的精子细胞。非渗透性冷冻保护剂通常是大分子物质，无法穿透精子细胞内部，不会破坏细胞内部结构。常见的非渗透性保护剂包括卵黄和脱脂乳等[20]。本文介绍了渗透性保护剂甘油和非渗透性保护剂卵黄在精液冷冻保存中的应用。
3.1 甘油在精液冷冻保存中的应用
甘油作为一种小分子物质，可以通过精子细胞膜进入精子内部，改变细胞内溶液浓度和物质组成，并通过降低细胞内溶液的冰点，减少精液冷冻保存过程中冰晶的形成，从而保护精子[21]。姜璐瑶等[22]研究表明，在冷冻稀释液中添加6%甘油作为冷冻保护剂，搭配-100～-10 ℃温区内以-40 ℃/min的速率进行降温的精液冷冻程序，更适合东佛里生奶绵羊精液的冷冻保存。在公羊精液冷冻保护剂中添加3%甘油+3%二甲基乙酰胺或4%甘油+二甲基乙酰胺，其冷冻保护效果较好[23]。席利萌等[18]评估了渗透性冷冻保护剂对山羊精子的抗冷冻保护作用，结果证明，以Tris卵黄为基础，稀释添加6%的甘油对山羊精液起到较好的保存效果。以上研究表明，甘油作为渗透性冷冻保护剂对精液冷冻保存具有积极作用。
3.2 卵黄在精液冷冻保存中的应用
卵黄是一种应用较广泛的非渗透性冷冻保护剂，具有丰富的卵磷脂和脂蛋白，可以保护精子细胞膜免受冰晶的刺破，防止精子冷休克[24]。然而，卵黄的使用可能会导致潜在的有害代谢产物和毒素生成，且卵黄成分具有显著的个体差异，不同禽类卵黄对山羊精液的冷冻效果影响也有不同。Swelum等[25]比较了各种禽类卵黄对山羊精液冷冻保存效果的影响，结果表明，在曲线速度、直线速度和渐进性运动等方面，相比于其他禽类卵黄稀释液，鸡卵黄稀释液在改善解冻后山羊的精子质量上有更好的效果。山羊精浆中的卵黄凝固酶能够将卵黄中的卵磷脂水解为脂肪酸和溶血卵磷脂，而溶血卵磷脂会对山羊精子的活力和顶体产生不利影响[26]，且卵黄作为动物源成分之一，易在冷冻过程和体外受精过程中受到微生物或其他物质的污染，所以研究者倾向使用植物源性冷冻保护剂代替卵黄，SL是其中一种代表性物质，范文华等[27]通过添加SL降低了卵黄的使用浓度，有效减少了溶血卵磷脂的生成量，降低了对精子的毒害作用。
综上，传统的山羊冷冻保护剂以卵黄为主，但其作为动物源成分，存在一定的生物安全性风险，且成分复杂，不易制备标准浓度的冷冻保护剂。因此选择替代卵黄的物质非常有必要。本文分析了SL和LDL在精液冷冻保存中的作用机理及应用，为改良山羊精液冷冻稀释液配方提供参考。
4 SL在精液冷冻保存中的作用机理及应用
SL是一种天然磷脂，含有丰富的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等成分。磷脂酰胆碱是细胞膜的重要组成部分，在精子冷冻保存过程中，可以维持精子细胞膜的流动性和稳定性，防止细胞膜在低温条件下发生硬化或损伤[28]。在精液冷冻保存中，SL能够模拟精子膜的脂质环境，减少冰晶形成，降低对精子的损伤。还可以通过减少ROS对精子的损伤，保护精子细胞膜的完整性和功能，维持细胞膜的稳定性，从而使其在冷冻和解冻过程中保持结构完整性[28]。此外，SL无法通过精子细胞膜，使得细胞外溶液浓度增加，精子细胞脱水，减少细胞内冰晶的形成，从而降低精子在冷冻保存过程中受到机械损伤的可能[29]。SL还能提高细胞外溶液的渗透压，增强精子对不同渗透压的抵抗能力，有助于减少精子质膜和顶体外膜的损伤[30]。Fukui等[31]使用以SL为基础的稀释液和含有卵黄的Tris稀释液进行人工授精，并比较了母羊的生育能力，结果发现SL在动物精子冷冻保存中表现出比卵黄更强的安全性能。
近年来，SL已广泛应用于猪、牛和鸡等动物的精液冷冻保存中。汪俊跃等[32]研究发现，利用5%高压均质SL替代卵黄对猪精液冷冻保存具有良好的效果，能有效提高精子质量，研究结果证明了SL替代卵黄的可行性和优势。Abdel-ghani等[33]研究表明，在0.125%卵磷脂纳米粒子的作用下，荷斯坦公牛的冷冻精子在平衡和解冻后显示出更出色的性能。Sun等[34]在稀释液中添加1.0%纳米SL可显著提高公鸡精液活力，改善质膜和顶体完整性，提高解冻后精子的线粒体活性，并增强了总抗氧化能力与超氧化物歧化酶活性，有效提升了公鸡精液解冻后的质量和生育能力，这一结果证明了SL在家禽精液冷冻保存程序中的应用价值。SL的优势还体现在山羊精液冷冻保存中，含有不同浓度SL的稀释剂能够有效保持精子的活力和功能，起到较好的冷冻保护效果[28]。Kasimanickam等[35]比较了不同稀释液对绵羊精子在液体储存期间的DNA碎片指数、线粒体膜电位和精子运动性的影响，结果发现，在绵羊精液冷冻保存中添加11%的SL精液保存效果良好，且精子的一些运动参数显著优于使用卵黄，揭示了SL作为动物源稀释液替代品的巨大潜力。王震[36]在绒山羊精液冷冻稀释液中联合添加LDL和SL代替卵黄，结果表明，该处理明显提高解冻后山羊精液的质量。Salmani等[37]研究结果显示，添加1.5% SL相较于卵黄，解冻后精子的活力和质膜完整性虽没有显著差异，但精子运动能力有所提升。
以上研究结果表明，SL不仅能够替代卵黄，而且在某些方面还具有更优的效果。此外，SL价格相对较低，更适合应用于大规模冷冻精液生产，并且不含蛋黄和奶粉等动物源性病毒和支原体，对于提高精液冷冻保存的安全性和可持续性具有重要意义。同时，使用SL作为冷冻保护剂，有助于减少对动物资源的依赖，符合当前对环境友好和可持续发展的要求。在精液冷冻过程中，通过调整SL浓度和与其他成分（如甘油、糖类等）的组合，可以优化山羊精液冷冻程序，提高精子的冷冻存活率和解冻后的人工授精效率。
5 LDL在精液冷冻保存中的作用机理及应用
LDL作为一种存在于鸡蛋黄中的脂蛋白，在胆固醇代谢和类固醇激素合成中发挥着关键作用[38]。在精液冷冻保存过程中，精子可能会遭受物理和化学损伤，导致结构和功能发生改变。LDL可与精液中的有害阳离子肽竞争性结合，防止有害物质与精子细胞膜结合，保护精子免受有害蛋白的损伤[39]。其通过保护细胞膜减少冰晶的形成，维持细胞膜的稳定性，从而降低冷冻损伤。另外，LDL可以隔离精浆中的骨唾液酸蛋白，防止其与精子表面结合，减少胆固醇在精子膜中的流失，从而最大限度地减少膜损伤和冷冻损伤[40]。单独添加LDL可以减轻甘油在精液冷冻保存中产生的毒性[41]。在哺乳动物的精液冷冻保存过程中，脂质过氧化是一种常见的问题，精子细胞膜膜中的PUFA受到氧化应激的影响，发生脂质过氧化反应，导致其受到损伤，影响精子的活力和功能。LDL中的抗氧化成分可以帮助减少这种氧化损伤，保护精子的DNA和膜结构，使用含有LDL的冷冻稀释液可以显著提高解冻后精子的活力，维持精子膜的完整性，保持精子的运动能力和授精潜力[42-43]。此外，LDL可以改善精子的运动特性，如直线速度、曲线速度和平均路径速度等，这对于精子的运动和授精过程至关重要[44]，且与卵黄相比，使用LDL作为冷冻保护剂不会影响动物的生育能力[45]。
近年来，在犬[46]、牛[47]和马[48]等动物的精液冷冻保存中，LDL已被广泛研究并应用于实践，显示出显著的保护效果。狄和双等[49]研究表明，在犬精液稀释液中添加8%或10%的LDL，能有效改善解冻后精子的活力。在山羊精液冷冻保存中LDL同样发挥优良效益，在冷冻稀释液中添加0.09 g/mL LDL时，可以有效冷冻保存绒山羊精液，冷冻保存效果优于使用卵黄 [36]。但LDL在山羊精液冷冻保存中的具体效果及原理还需大量实验证明，相关研究有待进一步深入。因此，对于不同品种的山羊，LDL的具体浓度仍需通过大量实验来确定。在实际应用中，研究人员需根据物种特性和冷冻保存的具体要求，优化LDL的浓度和配方，以达到较佳的保护效果。
6 SL和LDL联合应用的研究进展及前景
SL和LDL在精液冷冻保存过程中具有重要作用，两者均有望代替卵黄，作为精液稀释液冷冻保护剂应用于畜禽精液保存[50]。相比于单独使用SL或LDL，联合添加这两者也能显著改善解冻后精子的存活时间和运动参数。王震[36]比较了在山羊精液冷冻稀释液中单独添加与联合添加LDL和SL的冷冻保存效果，结果表明，联合添加0.04 g/mL LDL和1.5% SL显著提高了解冻后精子的运动参数和细胞膜完整性，说明LDL和SL具有良好的协同作用，能有效提高山羊精液的冷冻保存效果。这种联合作用可能是因为LDL在超低温冷冻时释放出磷脂和脂质，磷脂是构成细胞膜的生物活性物质之一，有利于促进细胞代谢和维持膜结构。SL作为卵黄中卵磷脂的替代物，在冷冻过程中可以补充受损的磷脂结构；降低细胞液冰点，减少冰晶形成，从而减少冰晶对精子的损伤[51]。也可能是LDL和SL均含有抗氧化成分，SL可以通过减少ROS的损伤保护精子细胞膜的完整性和功能[28]，而LDL中的抗氧化成分可以帮助减少脂质过氧化造成的损伤[43]，两者互补优势为精子提供更优的冷冻保护液。同时SL作为非渗透性冷冻保护剂，可以通过增加细胞外液的渗透压，促使细胞在冷冻时脱水，减少冰晶的形成[30]。LDL的加入可以进一步增强这种效果，提高精子的抗冻能力。因此，LDL和SL的结合使用可能产生协同效应，LDL增强了SL的冷冻保护作用，而SL提供了额外的抗氧化保护，共同提高精子在冷冻和解冻过程中的存活率，提高冷冻保护剂的整体效果。这种策略为提高不同动物精液冷冻保存的成功率提供新的视角。
综上，本文介绍了山羊精液冷冻保存技术及冷冻保存过程中的冷冻损伤和冷冻保护剂的应用，探讨了SL和LDL以及两者联用在山羊精液冷冻保存中的应用。LDL和SL在山羊精液冷冻保存中可以通过减少冰晶形成，减轻活性氧对精子的伤害等作用提高冷冻保存中精子的活力，且两者具备一定的联合效应。LDL和SL在精液冷冻保存中的应用前景广阔，但仍存在许多不足，如LDL和SL在山羊冷冻精液保存中的具体作用机制尚未完全明确，不同浓度和配比对精子冷冻保存效果的影响也需进一步研究。此外，针对不同物种的特定需求，开发定制化的冷冻保护剂也是未来研究的重要方向之一。LDL和SL作为冷冻保护剂，在山羊精液冷冻保存中展现出较大的潜力，能够提高精子在冷冻和解冻过程中的存活率。因此，充分挖掘LDL和SL在精液冷冻保存中的应用，对于遗传资源保护和优良品种推广具有重要意义。