随着染料工业的发展，工业染料废水成为生态环境重要污染源之一，水中的染料使得水体富营养化造成污染，导致水的色度增加，溶解氧减少，阳光穿透能力减弱，一些水生植物的光合能力也相应减弱，从而对水生环境造成一定的破坏[1-2]。孔雀石绿是一种三苯甲烷类染料，其结构较复杂，官能团稳定，可生物降解性低，毒性强[3]，如何实现其有效降解成为亟待解决的问题。
对于工业废水染料，一般采用物理或化学处理方法。物理方法有吸附、絮凝、过滤和超声波法等，其中吸附、絮凝和过滤效果一般、成本较高，且容易造成二次污染；超声波法可以起到降解作用，但容易受到环境影响；化学方法有电化学氧化、超临界水氧化等，其中电化学氧化法存在产物的分离问题，超临界水氧化法的应用受材料和设备限制，规模化应用有限。目前生物降解法成为处理工业废水染料的研究热点，包括生物降解和生物吸附，该方法因其具备高效、经济、绿色和无二次污染等特点，将逐步替代物理和化学处理方法[4]。Palma等[5]和宋金龙等[6]研究表明，可降解染料的微生物主要包括细菌、真菌、放线菌和藻类等，其中对真菌的研究较深入。真菌在自然界中广泛分布，具有较强的木质纤维素分解能力。司静等[7]研究表明，木质纤维素降解酶对染料具有较强的降解效果。使用真菌降解染料具有高效性、适用性强，能耗低，以及污染小等优点[8]。紫色马勃（Calvatia lilacina）属担子菌门的大型真菌，分布较广，药理作用表现多样，应用前景备受关注[9]。朱月等[10]研究表明，紫色马勃水溶性多糖对氧自由基具有清除作用，而其在染料降解方面的应用研究鲜有报道。基于此，本研究初步探讨了紫色马勃降解孔雀石绿染料的条件，了解其降解特性，为进一步开发利用紫色马勃和改善染料降解问题提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌种
紫色马勃由安徽科技学院综合实验中心保藏。
1.1.2 培养基
斜面培养基（PDA）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂16 g和水1 000 mL。液体发酵培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸氢二钾3 g，硫酸镁1.5 g和水1 000 mL。
1.1.3 试验试剂
蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、蔗糖和琼脂，均由中国医药上海化学试剂有限公司生产；马铃薯购自市场。
1.1.4 试验仪器
高压灭菌锅，北京海峰致远科技有限公司；恒温摇床，上海利闻科学仪器有限公司；UV-1800PC紫外可见光光度计，济南慧红医疗设备有限公司；培养箱，湖南力辰仪器科技有限公司；移液枪，德国Eppendorf有限公司；高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。
1.2 试验方法
1.2.1 孔雀石绿染料的平板降解
在经高压蒸汽灭菌的PDA培养基中加入过滤除菌的孔雀石绿溶液，使其终浓度达到1.0 g/L，冷却至50 ℃左右倒入平板，待充分凝固后，无菌操作接入直径约0.5 cm的紫色马勃菌块于平板中央，倒置于26 ℃培养箱中培养，定期观察菌丝体生长与染料的降解效果。
1.2.2 液体培养方法
将一支已活化的紫色马勃菌丝体接入250 mL三角瓶中，加入100 mL 液体发酵培养基，于26 ℃、160 r/min 的摇床中振荡培养，待液体菌种培养好后，用高速分散器10 000 r/min处理30 s，按10%的接种量，接入发酵培养基中，按设计加入孔雀石绿染料母液进行降解处理。
1.2.3 培养时间对染料降解的影响
将5 mg/mL的孔雀石绿染料母液分别加入到26 ℃，160 r/min振荡培养4、5和6 d的紫色马勃发酵液中，使染料的终浓度为100 mg/L，于26 ℃培养箱中振荡处理，24 h后取样，以不加染料的发酵液为对照，测定OD值，并计算降解率ω，设3次重复。
1.2.4 处理温度对染料降解的影响
将5 mg/mL的孔雀石绿染料母液加入26 ℃，160 r/min振荡培养4 d的紫色马勃发酵液中，使染料的终浓度为100 mg/L，分别于22、26、30和34 ℃的培养箱中振荡处理，24 h后取样，以不加染料的发酵液为对照，测定OD值，并计算降解率ω，设3次重复。
1.2.5 染料浓度对染料降解的影响
将5 mg/mL的孔雀石绿染料母液分别加入26 ℃，160 r/min振荡培养4 d的发酵液中，使染料的终浓度分别为50、100、150、200、250和300 mg/L，于26 ℃培养箱中振荡处理，24 h后取样，以不加染料的发酵液为对照，测定OD值，并计算降解率ω，设3次重复。
1.3 测定指标和方法
根据柏晓冉等[11]的方法，将待测培养液8 000 r/min离心2 min，取上清液，在616 nm波长下测定其OD值，计算降解率ω。在此基础上考察培养时间、处理温度和染料浓度对孔雀绿色降解率的影响。降解率计算如式（1） 。
ω（%）=（C 0-Ct ）/C 0×100
式中，C 0为刚加染料液的OD值；Ct 为加染料t时间后的OD值。
1.4 数据处理
利用Excel软件对数据进行处理分析，利用SPSS软件进行差异分析。
2 结果与分析
2.1 孔雀石绿染料的平板降解
由图1可知，紫色马勃在孔雀石绿终浓度为1.0 g/L的PDA平板上可以生长，但在此浓度下孔雀石绿对菌丝的生长具有一定的抑制作用。随着培养时间的延长，菌丝生长速度有所提高；同时平板中孔雀石绿的颜色随培养时间的增加逐渐变浅，说明紫色马勃可以通过代谢降解该染料。
2.2 培养时间对染料降解率的影响
由图2可知，培养4、5和6 d的发酵液处理染料溶液24 h的降解率分别为93.62%、94.62%和90.81%，呈现先升后降的趋势。4与5 d的降解率差异无统计学意义（P>0.05），但均高于6 d（P<0.05）。因此，初步确定培养时间以4 d为宜。
2.3 处理温度对染料降解率的影响
由图3可知，22、26、30和34 ℃培养的发酵液处理染料溶液24 h的降解率分别为91.33%、93.50%、96.28%和89.60%，其中30 ℃处理下，降解率最高，与其余组间差异存在统计学意义（P<0.05）。说明紫色马勃发酵液在不同温度处理下，对染料降解率均较高，初步确定处理温度以30 ℃为宜。
2.4 染料浓度对染料降解率的影响
3 结论与讨论
真菌对于染料的脱色作用主要依靠两个过程：吸附和生物降解[11]。菌丝体的吸附能力不仅与底物的亲和力相关，还与染料分子的结构密不可分[12]。染料分子结构变化会影响染料的降解率，不同的染料降解菌对不同结构的染料降解率有较大区别。杜晓明等[13]研究表明，染料芳香环上取代基团的种类、数量、位置以及染料分子量的大小均能影响其降解的效果。因此，同一种真菌对不同种染料的降解能力因染料分子结构不同以及真菌本身的降解酶不同而表现出差异性[14]。不同处理时间及温度均会对真菌的酶活性和反应速率产生影响，从而影响其降解率。本试验研究紫色马勃对孔雀石绿染料的降解性能，发现随着紫色马勃发酵液培养时间的延长，降解率呈先增后减的趋势，可能是该菌在不同的培养时间下，产生的酶量与活性不同导致的；随着温度的增加，其降解率呈先增后减的趋势，可能是在温度逐渐升高的情况下，发酵液中的酶活性上升且利于菌丝的生长，因此降解率开始上升。研究还发现，紫色马勃对孔雀石绿染料的降解率与初始染料浓度成反比，原因可能是过高的染料浓度对菌丝的生长和产酶量具有抑制作用，同时微生物胞外酶的分泌能力有限，也会导致降解能力下降。紫色马勃作为生物降解方法，处理染料废水具有高效、低成本、绿色、适应性强和无二次污染等优点，有着较好的应用前景。但本次试验是在实验室环境下进行的，而实际的工业染料废水环境并非是单一环境，因此会有较多因素对试验结果造成影响，如初始pH及一些金属离子等[15]，这些因素是否会对紫色马勃的降解性能产生影响，还有待进一步验证。
综上，本研究通过制备紫色马勃发酵液，研究其在不同的培养条件下对于孔雀石绿降解率的影响，得出紫色马勃制备条件为26 ℃，160 r/min 振荡培养4 d；孔雀石绿染料浓度为200 mg/L时，在30 ℃温度下，降解24 h，降解率98.34%。