活性干酵母是鲜酵母经脱水干燥、复水活化后仍具有较强发酵能力的干酵母制品[1]。其以淀粉或糖蜜为原料，辅以粗加工原料如酵母蛋白胨等，是一种以颗粒形式存在但不失去生物活性的酵母产品[2]。随着现代检测技术的不断发展，微生物多样性的研究方法也得到了发展壮大，目前的研究方法主要集中在传统的纯培养技术和现代的分子生物学技术上，前者主要包括平板划线培养、Biolog技术等，后者主要包括DNA探针杂交、PCR扩增技术等。高通量测序技术以其快速、准确的突出特点，被广泛应用于分析食品中的微生物多样性[3]。与传统微生物分离培养技术等方法相比，该方法可一次性对样品中的几十万到几百万条脱氧核糖核酸分子序列进行测定，从而快速确定微生物的种类和丰度[4]。该技术不仅可以展示微生物在门、属等水平的丰度及结构组成，还能合理预测相关功能，是微生物代谢分析的有效手段[5]。传统微生物分离培养技术和高通量测序技术目前已得到较多的应用，这两种方法各有特点，比如传统微生物分离培养技术难以准确反映微生物的实际构成情况，而高通量测序技术由于数据量大，对数据的处理和解析过程较烦琐，且成本较高，限制了其在食品工业中的推广[6]。因此在研究过程中，将两类方法有效结合，取长补短，才能更好地对产品的微生物多样性进行研究。
目前对活性干酵母的微生物多样性分析较少，本研究采用纯培养法与高通量测序技术对活性干酵母及其原料糖蜜和酵母蛋白胨的菌相构成进行研究，并对其中杂菌来源进行初步探讨，识别产品中可能存在潜在的危害或影响因子，有利于针对性改善工艺，降低生产成本，从而提高产品质量，为产品标准修订及产品创新提供参考，并为产品应用后期风味影响研究提供菌种资源。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
不同种类的活性干酵母（7种），糖蜜和酵母蛋白胨均来自市售，PCA培养基和营养肉汤，购自青岛海博生物技术有限公司；细菌扩增引物：标准细菌16S V3V4（a），真菌扩增引物：标准真菌ITS1（a）；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit、琼脂糖和TAE，购自Invitrogen。
1.2 仪器与设备
全自动微生物鉴定系统（梅里埃）、PCR扩增仪（ABI）、酶标仪（BioTek）、电泳仪（北京六一）、凝胶成像系统（北京百晶）。
1.3 微生物的分离鉴定
1.3.1 微生物的分离筛选
（1）平板计数琼脂筛选。参考GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》；称取25 g酵母于225 mL生理盐水中，均质2 min制成1∶10的样品匀液。吸取1∶10样品匀液1 mL于 9 mL生理盐水中，涡旋混匀，制成1∶100的样品匀液。依次制备10倍稀释系列样品匀液。吸取各样品匀液于无菌培养皿内，并加入平板计数琼脂培养基，转动混匀。待琼脂凝固后将平板倒置，（36±1）℃培养（48±2）h，观察平板上菌落生长情况，挑取不同的特征菌进行分离纯化。（2）营养肉汤增菌筛选。在无菌条件下，称取25 g酵母，加入225 mL营养肉汤，均质。于（36±1）℃培养20 h，划线转接营养琼脂平板，（36±1）℃培养24 h后，观察平板上菌落生长情况，对不同的特征菌落进行分离纯化。
1.3.2 微生物的鉴定
将分离纯化得到的不同特征菌落，进行革兰氏染色镜检，并用生化鉴定仪对分离的目标菌进行生化鉴定。
1.4 高通量测序
按照DNA 提取试剂盒说明提取样品的微生物群落总DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，采用Nanodrop测定DNA浓度和纯度。采用Pfu高保真DNA聚合酶，细菌使用16S V3-V4 区特异性引物（上游引物：ACTCCTACGGGAGGCAGCA；下游引物：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）进行PCR扩增，真菌使用ITS1（a）（上游引物：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；下游引物：GCTGCGTTCTTCATCGATGC）进行PCR扩增。具体体系见表1。
表1 PCR扩增体系 (μL) |
| 成分 | 体积 |
|---|---|
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | 0.25 |
| 5×Reaction Buffer | 5.00 |
| 5×High GC Buffer | 5.00 |
| dNTP （10 mM） | 2.00 |
| 模板 DNA | 2.00 |
| 正向引物（10 μM） | 1.00 |
| 反向引物（10 μM） | 1.00 |
| ddH2O | 8.75 |
PCR 扩增程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，重复该循环27次；最后72 ℃稳定延伸5 min。将扩增得到的DNA产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳，切取目的片段用Axygen 凝胶回收试剂盒进行回收。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit将PCR扩增回收产物进行荧光定量分析，根据荧光定量结果，根据每个样本的测序量要求，对各个样本按相应比例进行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库，采用Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库进行质检，再采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor荧光定量系统上对文库进行定量，将合格的上机测序文库梯度稀释后，根据测序量按比例混合，经NaOH变性后上机测序；建库与测序等工作委托武汉百易汇能生物科技有限公司完成。
1.5 数据分析
2 结果与分析
2.1 微生物的分离鉴定
根据菌落典型特征，从活性干酵母中分离出了4种菌，包括木糖葡萄球菌、鸡葡萄球菌、沃氏葡萄球菌、乳酸乳球菌乳亚种（表2）。
表2 典型菌落形态特征 |
| 培养方式 | 编号 | 菌落特征 | 生化鉴定结果 |
|---|---|---|---|
| 平板计数培养 | 1 | 浅黄色，凸起，不透明，边缘不整齐，菌落较大 | 木糖葡萄球菌 |
| 2 | 乳白色，凸起，不透明，边缘不整齐，菌落较大 | 鸡葡萄球菌 | |
| 3 | 乳白色，凸起，不透明，边缘整齐，菌落中等大小 | 沃氏葡萄球菌 | |
| 营养肉汤培养 | 1 | 凸起，半透明，边缘整齐，菌落较小 | 乳酸乳球菌乳亚种 |
2.2 高通量测序
2.2.1 细菌物种组成分析
本研究在属水平上统计出相对丰度排名前10的物种，绘制出各样品对应的物种相对丰度图。如图3所示，J-1酵母中主要有不动细菌属（Acinetobacter）、明串珠菌属（Leuconostoc）、杆菌属（Bacillus）；J-2酵母中主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、土芽孢杆菌属（Geobacillus）、肠球菌属（Enterococcus）；J-3酵母中主要有肠球菌属、土地杆菌属（Pedobacter）；J-4酵母中主要有杆菌属（Bacillus）、乳杆菌属、克雷伯氏菌属（Klebsiella）；J-5酵母中主要有魏斯氏菌属（Weissella）、明串珠菌属；J-6糖蜜中主要有明串珠菌属（Leuconostoc）；J-7酵母蛋白胨中主要有葡萄球菌属（Staphylococcus）；J-8、J-9酵母中主要有魏斯氏菌属（Weissella）、杆菌属、葡萄球菌属。综上，活性干酵母中通过高通量测序分析得到的酵母属水平的细菌主要集中在杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌以及葡萄球菌属。
2.2.2 真菌物种组成
由图4可知，J-5酵母中，仅有威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）；J-6糖蜜中，威克汉姆酵母属丰度比达到75%以上，还有少量结合酵母属（Zygosaccharomyces）；J-7酵母蛋白胨中，威克汉姆酵母属丰度比接近50%。由此可以看出，活性干酵母中主要的真菌为威克汉姆酵母属。
综上，结合细菌和真菌的物种组成，表明活性干酵母的主要微生物菌群为杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、葡萄球菌属以及威克汉姆酵母属；糖蜜的主要微生物菌群为明串珠菌属、威克汉姆酵母属和结合酵母属；酵母蛋白胨的主要微生物菌群为葡萄球菌属、威克汉姆酵母属。
3 结论与讨论
纯培养法和高通量测序技术是常见的微生物多样性分析方法。贾鑫等[3]基于纯培养法结合高通量测序技术，成功解析了胀袋辐照凤爪中的微生物多样性。本研究通过纯培养法及高通量测序技术分析活性干酵母中的微生物多样性。纯培养法结果表明，活性干酵母的主要微生物菌群为葡萄球菌和乳酸乳球菌。而高通量测序结果表明，活性干酵母的主要微生物为杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌以及葡萄球菌属和威克汉姆酵母属。作为活性干酵母生产的原料，糖蜜主要微生物菌群为明串珠菌属、威克汉姆酵母属和结合酵母属；酵母蛋白胨的主要微生物菌群为葡萄球菌属、威克汉姆酵母属。本研究为活性干酵母的微生物群落多样性研究提供一定理论参考，但其具体的酵母菌相分析，还需进行进一步的分析与研究。