石油烃污染是石油化工区土壤和水体生态系统面临的主要环境风险之一[1]。石油是由碳（C）和氢（H）两种元素构成的复杂混合物[2]，其主要化学组分包括烷烃、环烷烃和芳香烃三大类有机化合物，以及铜（Cu）、锌（Zn）、铅（Pb）和磷（P）等元素[3]。该复合污染物不仅能通过植物毒性效应抑制植物生长[4-5]，还会改变土壤理化性质。例如，石油污染物进入环境后会导致氮（N）、P等营养元素的生物有效性降低，引起土壤C/N、C/P和N/P等关键化学计量比失调[6]。石油烃的降解率与土壤中过氧化氢酶和酸性磷酸酶活性之间呈显著正相关，这为通过调控土壤酶活性来提高石油烃污染修复效率提供了依据[7]。植物根际效应使根际区域微生物丰度远高于非根际区域[8]，从而构建起污染物与植物根系间的微生物过渡屏障；此类微生物可与寄主植物形成菌根（真菌）或根瘤（细菌）等共生结构，其中具有改善土壤环境、促进植物生长或缓解环境胁迫等功能的微生物被定义为根际促生菌[9]。在“功能菌—植物”联合修复体系中，植物不仅能通过根系分泌物调节根际土壤理化环境，还可经由通气组织为根际菌群输送氧气和光合产物[10]。植物根际对污染物起到了固定作用，碳氢化合物（HCs）的降解主要通过植物根际附着的功能微生物完成[11]。该联合修复体系的修复效率与根际细菌的代谢活性密切相关[4]。微生物强化植物修复的另一作用机制涉及植物激素调节，研究表明大多数根际促生菌具有产生吲哚乙酸（IAA）的能力[12]，IAA可直接刺激植物根、茎和叶的发育；另有部分微生物通过产生细胞分裂素和ACC脱氨酶来调节植物乙烯代谢，从而增强植物抗逆性。研究显示，芽孢杆菌（Bacillus sp.）作为根际菌，可促使甘蓝幼苗分泌水杨酸和IAA，进而促进自身生长[13]。根际微生物群落在植物生长、土壤肥力维持、碳固定和污染物降解等过程中发挥重要作用[14]。在实践应用中，微生物—植物联合修复技术需根据污染物类别等来确定修复主体及机制。值得注意的是，微生物群落在高污染土壤中的适应性通常优于植物系统，而植物根际为微生物提供了必要的生存环境和代谢底物，二者形成协同修复体系。近年来，利用微生物—植物联合修复污染土壤已初见成效。张金秋[15]通过黑麦草、紫花苜蓿和高羊茅与高效石油降解菌的联合修复试验证实，紫花苜蓿—微生物体系的石油烃降解效率最高，修复效果最好。Guo等[16]在温室条件下开展了多环芳烃（PAHs）污染土壤的黑麦草修复试验，结果表明，在黑麦草存在下，可通过细菌多样性效应增强对PAHs的降解。本试验采用微生物—植物联合修复技术，探索高效的石油污染土壤生物修复技术体系。
1 材料与方法
1.1 供试材料
山羊草（Aegilops Linn.）种子购于黑龙江弗达拉种业有限公司；土壤样品为黑龙江大庆市星火牧场未被植被覆盖土壤（表土层5 ~ 10 cm）；Fusarium sp. shz-2.27菌株（大庆油田油污土壤中分离的原油降解真菌）；原油由大庆市采油二厂提供。
1.2 试验方法
1.2.1 培养基准备及菌种活化
分别配制PDA固体培养基和液体培养基；从保藏的Fusarium sp. shz-2.27（QS2305）菌株中挑取菌丝并接入平板，28 ℃培养4 d，挑取新生菌丝接种于液体培养基中，28 ℃，120 r/min振荡培养3 d，备用。
1.2.2 油污土壤配制
将土壤样品自然风干后过2 mm筛网，装入花盆中，每盆5 kg；取适量原油置于烧杯，沸水浴4 h，与石油醚配置成质量分数10%的石油母液备用；按质量比例（0、0.9%和1.5%）分别将石油母液（0、45和75 g）加入土壤中，搅拌均匀后放置2 d，待石油醚挥发后移入花盆。
1.2.3 种子处理
挑选健康状况良好的山羊草种子，用蒸馏水清洗，于50 ℃温水中浸泡30 min消毒，再浸种24 h，去除种皮；待全部种子萌芽后移植到准备好的花盆中，覆土厚度约1 cm，浇透水。
1.2.4 真菌与植物接种
空白组：分别取油污质量比例（0、0.9%和1.5%）的土壤各3盆，不做处理，放置56 d。植物组，将种子均匀播种于盆土中，每盆约50粒，覆土厚1 cm；真菌组，挑取直径2 cm的菌丝团，将菌液均匀倒入盆土中，覆土厚1 cm；植物+真菌组，先将菌液分别倒入盆土中，再每盆播种50粒草种，覆土厚1 cm；每个处理做3次重复，浇足水，每隔2～3 d浇透水一次，持续培养56 d。
1.2.5 植物根长与根重测定
挖出山羊草，去除根部泥土，并用蒸馏水冲洗根部，每组挑选出根长最长的10株进行测量，取平均值；将根部剪下，吸干水分，称量鲜重，然后置于烘箱70 ℃烘干至恒重，记录干重。
1.2.6 石油烃降解率测定
取土样10 g与30 mL石油醚混合后180 r/min振荡30 min；3 000 r/min离心10 min，取上清液，于通风橱内充分挥发，采用减重法测定土样中石油烃的降解率。
1.2.7 土壤酶活力测定
将油污浓度0、0.9%和1.5%的土样置于37 ℃烘箱风干后过100目筛，按照Solarbio土壤酶活性检测试剂盒使用说明书分别进行多酚氧化酶、脂肪酶、脲酶和脱氢酶的活力测定。
1.2.8 土壤理化性质测定
2 结果与分析
2.1 不同接种处理的植株生长量和石油烃降解率
如图3所示，在山羊草与真菌混合接种的土壤中，石油烃的降解率最高。空白组也显示出一定的降解率，推测除测量误差外，与土壤中土著微生物的作用有关。在仅接种真菌的处理中，石油烃的降解率均超过了46%，并且随着土壤油污浓度的升高，降解率呈缓慢上升趋势；接种植物组的油污土壤中，降解率相较于真菌组高，且随着浓度的提高降解率有所提高，说明山羊草对于高浓度的油污土壤较敏感；而同时接种真菌与山羊草组的处理中，整体降解率普遍高于单一接种的处理。值得注意的是，高浓度的油污可能对山羊草根系生长产生抑制效应，导致与真菌的协同作用在1.5%油污浓度下效果有所减弱。因此，在油污土壤修复技术的实际应用中，须综合考量山羊草与真菌生长的适应性，以获得更佳的油污去除效果。
2.2 不同接种处理的土壤样品酶活力
2.2.1 多酚氧化酶
如图4所示，植物+真菌组土样中多酚氧化酶活力明显高于空白组和单一处理组，在0.9%油污浓度时酶活力达1 012.580 U/g，说明真菌和山羊草联合接种明显提高了土壤中多酚氧化酶的活力；随着油污浓度升高至1.5%，酶活力下降至833.840 U/g。这可能是高浓度的油污对山羊草的生长及生理活动产生了抑制效应。
2.2.2 脂肪酶
如图5所示，植物组的脂肪酶活力呈下降趋势，可能是油污浓度的上升对植物产生了抑制作用；在0.9%油污浓度条件下，真菌组土样中脂肪酶活力达到最高值，为269.189 U/g，而油污浓度在1.5%时，其活力明显降低，降幅约38%。相对地，山羊草+真菌组土壤中脂肪酶活力与真菌组相反，在1.5%油污浓度下酶活力略高于真菌组。这表明较高的油污浓度对单独接种真菌的脂肪酶活力具有明显的抑制作用，而在山羊草与真菌共同接种时，二者间的协同作用明显增强了脂肪酶对油污环境的适应能力。
2.2.3 脲酶
由图6可知，植物+真菌组的土样中脲酶活力明显高于空白组与单一处理组，在0.9%油污浓度时，其活力达264.088 U/g；油污浓度在1.5%时其活力有所下降。这可能是由于较高浓度的油污对山羊草的生长及生理活动产生抑制效应。
2.2.4 脱氢酶
如图7所示，空白组和真菌组土壤中的脱氢酶活力均呈下降趋势，且空白组的土样中脱氢酶活力最低；在山羊草+真菌组土壤中，脱氢酶活力随着油污浓度的升高而略有升高，在1.5%油污浓度时，达到14.893 U/g，相较于真菌组，山羊草与真菌共同接种明显提高了土壤中脱氢酶活力对油污浓度的适应性。
以上4种土壤酶活力的测定分析结果表明，山羊草与真菌联合接种的方式明显提升了其对油污环境的适应性，推测其原因在于山羊草根部的分泌物为真菌提供了必要的营养和保护机制，而真菌缓解了山羊草所受胁迫，二者在油污土壤中形成互利互惠体系，进而促进了土壤中多种酶活力的提升。
2.3 不同接种处理土壤样品的理化性质
对不同处理土壤样品的总氮含量、总糖含量、pH以及电导率等理化指标进行检测，结果如表1所示。
表1 不同处理土壤样品的理化性质 |
| 理化指标 | 空白组 | 真菌组 | 植物组 | 真菌+植物组 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.9% | 1.5% | 0 | 0.9% | 1.5% | 0 | 0.9% | 1.5% | 0 | 0.9% | 1.5% | |
| 总氮/（g/kg） | 0.080 | 0.053 | 0.028 | 0.085 | 0.075 | 0.035 | 0.081 | 0.096 | 0.041 | 0.083 | 0.103 | 0.047 |
| 总糖/（mg/g） | 0.426 | 0.314 | 0.220 | 0.426 | 0.265 | 0.309 | 0.932 | 0.419 | 0.227 | 1.412 | 0.553 | 0.299 |
| pH | 7.075 | 7.607 | 8.630 | 6.967 | 6.553 | 6.430 | 7.102 | 6.857 | 6.615 | 7.063 | 6.860 | 6.810 |
| 电导率/（μS/cm） | 175.01 | 168.48 | 156.95 | 246.01 | 194.92 | 193.63 | 166.52 | 154.17 | 148.52 | 178.73 | 166.63 | 165.83 |
2.3.1 总氮
空白组的土壤总氮含量随着油污浓度的升高呈降低趋势，其可能与油污染使土壤中的原有氮素流失有关；真菌组的土壤总氮含量随着油污浓度的升高而下降，这可能暗示油污浓度对真菌功能具有一定激活作用，从而促进了其新陈代谢；真菌+植物组的土壤总氮含量在0.9%油污浓度时达到最高值（0.103 g/kg），而在1.5%油污浓度时其含量下降至0.047 g/kg，这可能是由于油污浓度的提高对植物的生理活动产生了抑制效应；该抑制作用在植物组中也有所体现。尽管如此，该处理的土壤含氮水平仍高于其他两组处理。
2.3.2 总糖
空白组和植物组的土壤总糖含量随着油污浓度的增加呈下降趋势，这可能是由于油污浓度的增加对植物的糖代谢产生一定的抑制作用；真菌组的土壤总糖含量呈先下降后上升趋势，在1.5%油污浓度时其含量出现上升，推测较高浓度的油污土壤可能促进了真菌糖代谢功能的激活；真菌+植物组的土壤总糖含量在无油污染物条件下达到最高值，为1.412 mg/g，且在0.9%和1.5%油污浓度下，其总糖含量在相应浓度油污土壤中维持较高水平。
2.3.3 pH
空白组的土壤pH在无油污染条件下维持在中性水平，随油污浓度的增加土壤pH明显升高。接种真菌和山羊草的油污土壤pH均呈下降趋势，推测是由于土壤中易降解的石油烃转化为脂肪酸，脂肪酸在土壤中积累。相比单一处理，植物+真菌组处理的土壤pH更接近中性。
2.3.4 电导率
本试验使用的是砂质风干土样，土壤电导率可能偏低，但该偏差在可接受误差范围内。随着油污浓度的升高土壤电导率略有降低。经56 d培养后，两接种组的土壤电导率均有所上升。在相同油污浓度下，真菌组的土壤电导率更高，表明该处理土壤中离子物质提高更多，从而导致电导率提升更高。真菌+植物组的土壤电导率明显高于植物组，这可能是由于真菌和山羊草联合接种增加了植物的抗逆性，分解土壤中多环芳烃等有机化合物所导致。
综上，山羊草与真菌联合接种的方式在土壤理化性质改善方面展现出良好效果，对于提升土壤肥力、降解多环芳烃等有机化合物具有积极作用。在实际土壤修复实践中，须考虑土壤油污浓度对山羊草生长的潜在抑制作用，以实现修复效果最大化。
3 结论与讨论
本研究探究了山羊草与真菌对油污染土壤的修复效果，植物根系生长量测定结果表明，随着土壤油污浓度的升高，植物的平均根长逐渐变短，说明油污浓度越高，对植物根系的生长抑制作用越强。石油降解率的测定结果表明，植物与真菌联合接种的土壤中石油烃的降解率在65.37%～78.67%，说明植物与真菌的联合接种有效促进了土壤中石油污染物的去除。张金秋[15]在试验中也得到了类似结论，利用紫花苜蓿、黑麦草与铜绿假单胞菌联合接种对土壤中的石油污染物去除率明显高于植物单一接种的去除率，去除率在62.6%～71.9%。土壤理化指标检测发现，真菌与山羊草共同接种处理的土壤pH较接近中性，电导率值高于植物组，多酚氧化酶、脂肪酶、脲酶和脱氢酶的活力明显高于单独接种真菌的处理；土壤总糖和总氮含量方面，植物与真菌联合接种的土壤中总糖与总氮含量均高于植物单独培养，说明Fusarium sp. shz-2.27+植物联合修复的方法明显降低了油污土壤对于植物生长和生理活动的抑制作用，增强了植物的抗逆能力[19]。以上结果均说明，在石油污染土壤的生物修复方法中，相比单独采用植物和微生物修复技术，植物—微生物联合修复技术作为一种更为有效且可行的绿色修复技术[20]，在去除污染物的同时，能够改良土壤性状、促进植被恢复以及改善生态环境，展现出更为卓越的环境保护效果。本试验针对石油污染对植物生长量变化、土壤理化性质、土壤酶活力等微生物—植物联合修复关键问题进行研究，进一步验证了微生物—植物联合修复方法在改善石油污染土壤方面的显著成效，为石油污染土壤生物修复技术的实践应用提供参考。