玛卡总皂苷促人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡作用研究

王涵; 徐兵; 杨紫焰; 陈贵元; 张翠香; 李雪英

doi:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.09.024

安徽农学通报 >

2025 , Vol. 31 >Issue 9: 111 - 115

DOI: https://doi.org/10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.09.024

生物资源·利用

玛卡总皂苷促人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡作用研究

王涵 ¹ ,
徐兵 ² ,
杨紫焰 ¹ ,
陈贵元 ¹^,³ ,
张翠香 ¹ ,
李雪英 ¹

展开

¹大理大学医学部，云南大理 671000
²重庆大学附属涪陵医院，重庆涪陵 408000
³大理大学云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000

李雪英（1976—），女，云南大理人，硕士，讲师，从事天然产物提取纯化及活性研究。

王涵（1999—），女，湖北孝感人，从事植物皂苷提取及功能研究

徐兵（1984—），男，重庆涪陵人，硕士，医师，从事植物皂苷提取及功能研究。

Copy editor: 胡立萍

收稿日期: 2024-12-05

网络出版日期: 2025-05-13

基金资助

国家自然科学基金地区项目(31860252)

云南省自然科学基金地方高校联合面上项目(202301BA070001-043)

大理州科技重点研发计划专项(20242903B030014)

云南省昆虫生物医药研发重点实验室科研开放项目(AG2022006)

收起

Effect of Lepidium meyenii Walp.saponin on promoting apoptosis of human retinoblastoma Y79 cells

WANG Han ¹ ,
XU Bing ² ,
YANG Ziyan ¹ ,
CHEN Guiyuan ¹^,³ ,
ZHANG Cuixiang ¹ ,
LI Xueying ¹

Expand

¹College of Medicine, Dali University, Dali 671000, China
²Fuling Hospital Affiliated to Chongqing University, Fuling 408000, China
³Yunnan Provincial Key Laboratory of Insect Biopharmaceutical Research and Development, Dali University, Dali 671000, China

Received date: 2024-12-05

Online published: 2025-05-13

Fold

摘要

为探究玛卡总皂苷（LMS）促人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的作用及机制，以玛卡为试验材料，提取其皂苷，研究不同浓度LMS（0、100、200、400和800 μg/mL）在不同处理时间（24、48、72 h）下对Y79细胞增殖和凋亡的影响；并测定Y79细胞促凋亡相关因子半胱氨酸蛋白酶家族成员Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的基因和蛋白表达量。结果表明，50 g玛卡干粉可提取2.58 g总皂苷，提取得率为5.16%。LMS处理可抑制Y79细胞的增殖，诱导其凋亡，其中400 μg/mL LMS处理48 h的作用效果较好，细胞存活率为54.05%，凋亡率为21.87%。此条件下，LMS可促进Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因的表达，上调Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase-9蛋白的表达。综合结果表明，LMS能抑制Y79细胞的增殖，并诱导其凋亡，其作用机制可能与促凋亡相关因子Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的基因和蛋白表达量上调有关。

关键词： 视网膜母细胞瘤; 玛卡总皂苷; 细胞增殖; 细胞凋亡

本文引用格式

王涵 , 徐兵 , 杨紫焰 , 陈贵元 , 张翠香 , 李雪英 . 玛卡总皂苷促人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡作用研究[J]. 安徽农学通报, 2025 , 31(9) : 111 -115 . DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.09.024

Abstract

To investigate the effect and mechanism of Lepidium meyenii Walp. saponin (LMS) in promoting apoptosis of human retinoblastoma Y79 cells, Lepidium meyenii Walp. was used as the experimental material to extract its saponins. Y79 cells were treated with different concentrations of LMS (0, 100, 200, 400, and 800 μg/mL), and the effects of LMS on Y79 cell proliferation and apoptosis at different treatment times (24, 48, and 72 h) were detected. The expression levels of pro-apoptotic factors, including Caspase-3, Caspase-8, and Caspase-9 genes and proteins, were measured. The results showed that 2.58 g of total saponins were extracted from 50 g of maca dry powder, with an extraction yield of 5.16%. LMS treatment inhibited the proliferation of Y79 cells and induced their apoptosis, with the optimal effect observed at 400 μg/mL for 48 h, resulting in a cell viability rate of 54.05% and an apoptosis rate of 21.87%. Under these conditions, LMS promoted the expression of Caspase-3, Caspase-8, and Caspase-9 genes and upregulated the expression of Cleaved caspase-3, Cleaved caspase-8, and Cleaved caspase-9 proteins. In conclusion, LMS can inhibit the proliferation of Y79 cells and induce their apoptosis, and its mechanism may be related to the upregulation of pro-apoptotic factors Caspase-3, Caspase-8, and Caspase-9.

Key words： retinoblastoma; Lepidium meyenii Walp. saponin; cell proliferation; cell apoptosis

视网膜母细胞瘤也称视网膜恶性胶质瘤（Retinoblastoma，RB），是由于抑癌基因RB1突变或缺少引发的婴幼儿眼内恶性肿瘤之一^[1]。视网膜母细胞瘤随着病情的恶化，可能会导致失明，甚至危及生命^[2-3]。玛卡（Lepidium meyenii Walp.）是一种十字花科一年生草本药食同源植物，其具有缓解疲劳、抗氧化、抗衰老等多种作用^[4-5]。杨采霞等^[6]研究表明，玛卡复方提取物不会损伤小鼠的肝肾组织且对游泳力竭小鼠具有抗疲劳作用。史俊友等^[7]从玛卡中提取出了较多的抗氧化成分。

皂苷作为一种天然活性成分，具有免疫调节等多种生物学活性。祝明涛等^[8]研究指出，植物皂苷具抗肿瘤活性。李月等^[9]利用乙醇回流法成功提取了玛卡总皂苷（Lepidium meyenii Walp.saponin，LMS）。目前，关于LMS抗肿瘤活性的研究有待深入，本研究以LMS为试验药物，处理人视网膜母细胞瘤Y79细胞，探究LMS对其凋亡的诱导作用及分子机制，为开发皂苷类抗人视网膜母细胞瘤天然药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人视网膜母细胞瘤Y79细胞株（货号 SNL-532），购自武汉尚恩生物技术有限公司。玛卡，购自云南省迪庆藏族自治州香格里拉县药材市场，经鉴定为十字花科植物玛卡的干燥根茎。

1.2 试验试剂与仪器

人参皂苷标准品Rb1、蛋白质免疫印迹发光试剂，均购自大连美仑生物技术公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清，均购自Thermo scientific公司；增强型CCK-8试剂盒，购自碧云天生物技术公司；细胞凋亡检测试剂盒、HiScript® II Q RT SuperMiX for qPCR 逆转录试剂盒、ChamQTM SYBR® qPCR Master MiX试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技公司；β-肌动蛋白（β-actin）单抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved caspase-3）单抗（14220S）、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-8（Cleaved caspase-8）单抗、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Cleaved caspase-9）单抗，均购自CST公司；羊抗兔二抗，购自武汉ABclonal technology公司；RNA提取试剂盒，购自上海普飞生物技术公司；其他试剂均为国产分析纯。

Gel Doc XR型凝胶成像系统（Bio-Rad）；Trans-Blot SD cell Western转膜仪（Bio-Rad）；MB-530型酶标仪（深圳汇松科技公司）；SW-CJ-2F型洁净操作台（苏州安泰空气技术公司）；HF212型细胞培养箱（上海申力仪器公司）；CKX53型显微镜（Olympus Corporation）；ND2000微量分光光度仪（Thermo Fisher）；Stepone Real-Time PCR System（Thermo Fisher）；MiniChemi K4型化学发光仪（北京赛智科技公司）；ACEA NotoCyteTM Flow cytometer（ACEA Biosciences Inc.）。

1.3 实验方法

1.3.1 LMS的提取

参照文献[9]的方法提取LMS，取一定质量的玛卡粉末（80目），3倍体积石油醚脱脂，离心，滤渣40 ℃烘干，采用50%乙醇，料液比1∶30（g/mL），80 ℃，提取4 h，离心收集上清液，旋蒸浓缩，冷冻真空干燥，得LMS。采用人参皂苷Rb1作为标准品，以吸光度为x，总皂苷质量浓度为y，参考文献[10]绘制标准曲线。同法制作LMS检测液，以去离子水作参照，测定550 nm波长处LMS的吸光度值，代入人参皂苷Rb1标准曲线，计算LMS质量浓度（ρ），LMS的得率（Y）计算如式（1）。

Y (%) = ρ V N m × 100

（1）

式（1）中，Y为LMS得率，%；ρ为LMS质量浓度，mg/mL；V为LMS提取液总体积，mL；m为玛卡原料质量，g；N为LMS的稀释倍数。

1.3.2 细胞培养及LMS溶液配制

采用RPMI 1640完全培养基，37 ℃、5% CO₂培养Y79细胞，细胞密度80%左右进行传代及实验。采用RPMI 1640完全培养基作为溶剂，配制初始浓度为800 μg/mL的LMS溶液，除菌过滤后备用。

1.3.3 细胞增殖检测

将100 μL的1×10⁵个/mL Y79细胞悬液接种于96孔板内，采用细胞存活率反映LMS（LMS）对Y79细胞增殖的影响。试验分为正常培养的Y79细胞组（对照组），不同浓度LMS试验组，以及只有完全培养基的空白组，每组设置3个复孔。对照组每孔加入90 μL RPMI 1640完全培养基，试验组每孔加入90 μL LMS溶液，浓度分别为100、200、400、800 μg/mL，分别培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL CCK-8试剂，于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育3 h，冷却至室温后，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值。细胞存活率R计算如式（2）。

R (%) = A 1 - A 0 A 2 - A 0 × 100

（2）

式（2）中，R为细胞存活率，%；A ₁为实验组吸光度值；A ₂为对照组吸光度值；A ₀为空白组吸光度值。

1.3.4 细胞凋亡率检测

取六孔板，每孔接入1×10⁵个Y79细胞，培养8 h，弃培养液。试验组加入LMS培养液，对照组加入等体积的RPMI 1640完全培养基。培养分别培养24、48、72 h，1 000 r/min离心5 min收集细胞，PBS洗涤两次，每孔加入100 μL 1× Binding buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和PI混匀，避光室温反应10 min，加入400 μL 1×Binding buffer混匀，上机检测。

1.3.5 基因表达量检测

取六孔板，每孔接入1×10⁵个Y79细胞，培养48 h，1 000 r/min离心5 min收集细胞，按照RNA提取试剂盒说明书和逆转录试剂盒说明书的操作方法提取RNA和合成cDNA。选取β-actin基因作为内参，采用荧光定量PCR检测基因相对表达量，PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；随后进行30个循环的扩增（95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s）；反应结束后采集各样本的Ct值。2^-ΔΔCt计算基因相对表达量。采用 NCBI Primer-BLAST工具进行引物设计，各基因引物序列见表1。

表1 引物序列

基因名称	NCBI编号	引物序列（5'-3'）	大小/bp
Caspase-3	NM_032991.2	F：GGTTCATCCAGTCGCTTTG R：ATTCTGTTGCCACCTTTCG	99
Caspase-8	NM_001228.4	F：TTCCTGAGCCTGGACTACATT R：GAAGTTCCCTTTCCATCTCCT	202
Caspase-9	NM_001229.4	F：ACTAACAGGCAAGCAGCAAA R：CCAAATCCTCCAGAACCAAT	140
β-actin	NM_001101.3	F：CTGGGACGACATGGAGAAA R：GCACAGCCTGGATAGCAAC	182

1.3.6 蛋白表达量检测

取六孔板，每孔接入1×10⁵个Y79细胞，培养48 h后，每孔加入适量的蛋白裂解液，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，收集上清，BCA法检测蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，将凝胶中的蛋白质电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2小时，1∶1 000一抗4 ℃孵育过夜，TBST（Tris-borate-sodium tween-20）缓冲液洗PVDF膜3次，每次3 min，1∶2 000二抗室温孵育2 h，置于化学发光仪中进行蛋白质免疫化学发光显影。

1.4 数据处理

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 LMS的提取得率

按照参考文献[10]绘制人参皂苷Rb1标准曲线，得线性回归方程y=0.002 8x－0.016，R ²=0.997 8。表明在20～120 µg/mL范围内，人参皂苷Rb1质量浓度与吸光度值呈线性关系。准确称取50 g玛卡干粉，按照试验方法提取LMS，可获得2.58 g精制LMS，提取得率为5.16%。

2.2 LMS对Y79细胞增殖的影响

由表2可知，LMS处理Y79细胞24 h后，100、200 μg/mL组的细胞存活率分别为93.37%、89.13%，与对照组相比（0 µg/mL），差异无统计学意义（P>0.05）；400、800 μg/mL组的细胞存活率分别为78.27%、31.93%，明显低于对照，且差异具有统计学意义（P<0.05）。LMS处理Y79细胞48 和72 h后，不同浓度LMS均能降低Y79细胞的存活率，且与对照差异具有统计学意义（P<0.05），以400、800 μg/mL的降低作用更明显（P<0.01）。综合考虑，后续选取浓度400 μg/mL的LMS开展试验。

表2 不同浓度LMS和处理时间对Y79细胞增殖的影响 (%)

LMS浓度/（μg/mL）		细胞存活率
LMS浓度/（μg/mL）	24 h	48 h	72 h
0	94.34±0.67	93.70±0.84	94.07±1.51
100	93.37±1.22	88.33±2.19^*	41.08±3.24^**
200	89.13±2.55	70.26±3.56^*	30.85±2.37^**
400	78.27±3.38^*	54.05±2.97^**	23.95±2.84^**
800	31.93±3.04^**	18.50±0.71^**	12.30±1.35^**

注：*和**分别表示与对照组相比差异在0.05和0.01水平具有统计学意义。

2.3 LMS对Y79细胞凋亡的影响

由图1可知，400 μg/mL的LMS处理Y79细胞，与对照组相比，LMS组细胞的凋亡、坏死明显增多。随着LMS干预时间的增加，细胞凋亡率逐渐增加。由表3可知，400 μg/mL的LMS处理Y79细胞24、48和72 h后，细胞凋亡率分别为15.59%、21.87%和29.00%，与对照差异均具有统计学意义（P<0.01）。表明LMS可促进Y79细胞凋亡。

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图1 LMS对Y79细胞凋亡的影响

Q2-1为机械损伤细胞量；Q2-2为晚期凋亡量；Q2-3为正常细胞量；Q2-4为早期凋亡细胞量。

表3 LMS在不同时间点对Y79细胞凋亡的影响 (%)

LMS浓度/

（μg/mL）

凋亡率

24 h

48 h

72 h

2.31±0.40

2.88±0.50

3.06±0.63

400

15.59±1.91^**

21.87±1.71^**

29.00±2.11^**

2.4 LMS对Y79细胞基因表达量的影响

由图2可知，400 μg/mL的LMS处理Y79细胞48 h后，LMS组细胞的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的相对表达量明显高于对照组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。表明LMS可上调Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表达。

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**图2 LMS对Y79细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因表达的影响**

*和**分别表示组间差异在0.05和0.01水平具有统计学意义。

2.5 LMS对Y79细胞蛋白表达的影响

由图3可知，400 μg/mL的LMS处理Y79细胞48 h后，LMS组Y79细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase-9蛋白的表达量高于对照组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。该结果与荧光定量PCR结果相符，表明LMS可能通过上调促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表达，诱导Y79细胞凋亡。

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图3 LMS对Y79细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9蛋白表达的影响

（A）表示蛋白质显影;（B）表示蛋白质相对表达量。

3 结论与讨论

目前对RB的治疗主要采用激光光凝术及眼动脉化疗、玻璃体腔内化疗等^[11]。大多化疗药物具有较大的副作用，中药治疗具有疗效好、副作用小和价廉等优点^[12]。本研究探讨了LMS对人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的影响，发现LMS可抑制Y79细胞增殖，诱导其凋亡，表明LMS可能具有开发抗RB治疗药物的潜力。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是诱导细胞凋亡的重要家族之一^[13]，其中Caspase-8是启动凋亡的重要因子，活化的Caspase-8（Cleaved caspase-8）可引起Caspase成员的凋亡级联反应，破坏细胞内的死亡结构蛋白及相关功能蛋白，从而引起细胞发生凋亡^[14]。活化的Caspase-9（Cleaved caspase-9）可裂解细胞生长蛋白，从而促进细胞凋亡^[15]。Caspase-3几乎参与了所有的凋亡过程，活化的Caspase-8和Caspase-9能够激活Caspase-3（Cleaved caspase-3）从而加速细胞凋亡^[16]。本研究结果显示，LMS可促进Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因的表达，上调Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8和Cleaved caspase-9蛋白的表达，表明LMS可能通过促进相关细胞凋亡因子的表达，从而诱导Y79细胞凋亡。

综上，本研究探讨了LMS对人视网膜母细胞瘤Y79细胞凋亡的影响，结果表明，LMS可抑制Y79细胞增殖，诱导Y79细胞凋亡，其作用机制可能与Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9基因和蛋白表达量上调有关。研究结果为LMS作为临床上治疗RB的新型药物的开发提供参考。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

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Abstract

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 试验试剂与仪器

1.3 实验方法

1.3.1 LMS的提取

1.3.2 细胞培养及LMS溶液配制

1.3.3 细胞增殖检测

1.3.4 细胞凋亡率检测

1.3.5 基因表达量检测

表1 引物序列

1.3.6 蛋白表达量检测

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 LMS的提取得率

2.2 LMS对Y79细胞增殖的影响

表2 不同浓度LMS和处理时间对Y79细胞增殖的影响 (%)

2.3 LMS对Y79细胞凋亡的影响

图1 LMS对Y79细胞凋亡的影响

表3 LMS在不同时间点对Y79细胞凋亡的影响 (%)

2.4 LMS对Y79细胞基因表达量的影响

图2 LMS对Y79细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因表达的影响

2.5 LMS对Y79细胞蛋白表达的影响

图3 LMS对Y79细胞Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-8及Cleaved caspase-9蛋白表达的影响

3 结论与讨论

参考文献

**图2 LMS对Y79细胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因表达的影响**