赤霉病（Fusarium head blight）是小麦生产上的主要病害之一，主要由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起[1]。近年来，受全球气候变化及农业种植模式改变的影响，小麦赤霉病发生频率逐渐增加，造成了较严重的产量损失[2-3]。除产量损失外，禾谷类镰刀菌还会在谷物中产生以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）为主的多种真菌毒素，影响小麦的品质和经济效益[4-5]。因此，如何有效防控该病害的发生，成为相关研究人员高度关注的问题。
目前，小麦赤霉病的防治以化学防治为主，包括多菌灵及其复配剂、咪鲜胺、戊唑醇以及30%多·酮WP等新型药剂[6-8]。然而，长期施用化学杀菌剂，会引起病原菌的抗药性增加，小麦籽粒农药残留和环境污染等问题[9]。王文肖等[10]研究发现，部分地区存在多菌灵抗性菌株，影响化学防治药剂的施用效果。因此，在植物病害综合治理中，利用拮抗微生物进行生物防治，以减少化学药剂的施用是近年来的研究热点。利用芽孢杆菌、酵母菌、木霉菌、放线菌等生防菌防控赤霉病等植物病原真菌，具有环境友好、安全低毒、不易产生抗药性等优点，应用前景广阔[4，11]。其中，作为植物根际促生菌，芽孢杆菌具有抗逆性强，生长速度快，发酵周期短等特点，还可以产生脂肽、聚酮等活性物质拮抗病原菌。此外，其可以通过定殖、竞争和诱导寄主抗性等方式抑制病原菌的生长发育，并促进植物生长[10，12]。因此，该菌可作为环境友好型生防制剂用于作物病害防控和产量提升。本研究以贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis SX1302为试验菌株，研究该菌株对禾谷镰刀菌的拮抗作用和对田间小麦赤霉病发生的防控作用；以及其对小麦生长的影响，评价该菌株的生防应用潜力，为该菌株应用于小麦赤霉病的防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis SX1302由安徽科技学院基础实验中心前期从小麦赤霉病发病田块土壤中分离、鉴定和保存。禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum F0601）由安徽科技学院基础实验中心分离、筛选、鉴定和保存。
1.2 B. velezensis SX1302对F. graminearum的拮抗作用
1.2.1 平板拮抗试验
F. graminearum F0601接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），28 ℃培养5 d。采用无菌打孔器，从培养物边缘部分取直径为5 mm的菌丝块，置于新制备的 PDA平板中心。在距离中心菌丝块3 cm的4个等距位置处接种菌株B.velezensis SX1302。以只接种禾谷镰刀菌F. graminearum、不接种B. velezensis SX1302的PDA平板作为对照。所有处理均进行3次重复，平板在28 ℃恒温培养箱中培养5 d。
1.2.2 不同组分抑制效果试验
为进一步分析B. velezensis SX1302培养物不同组分对禾谷镰刀菌生长和DON产生的抑制效果。采用NB培养基，28 ℃摇床（180 r/min）中过夜培养B. velezensis SX1302。随后，培养液5 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀和上清液。参照Shu等[13]的方法，分别制备细胞悬浮液、无细胞上清液、热处理无细胞上清液（121 ℃灭菌20 min）和细胞裂解内容物。
1.2.2.1 孢子萌发抑制试验
从培养5 d的F. graminearum PDA平板上挑取菌丝体，接种于含有100 mL CMC 培养基（1.5 g CMC、0.05 g NH4NO3·7H2O、0.1 g 酵母提取物和100 mL H2O）的三角瓶中。置于 25 ℃摇床（180 r/min）培养5 d，用无菌纱布过滤培养液以去除菌丝，并将孢子悬浮液浓度调整为5×105分生孢子/mL。参照周清等[11]方法，将孢子悬浮液5 000 r/min离心3 min，以收获孢子。随后，将孢子分别加入1 mL 不同组分中，以1 mL无菌水作为对照。每处理重复3次。所有处理均在25 ℃恒温摇床（180 r/min）中培养，每天检查并计算孢子萌发率。
1.2.2.2 菌丝生长抑制试验
参考Pan等[14]的方法，以无菌水作为对照，将B. velezensis SX1302的细胞悬浮液、无细胞上清液、热处理无细胞上清液和细胞裂解内容物以10%（体积分数）的比例，接入PDA培养基中，混合均匀后倒培养皿。待PDA培养基凝固后，在PDA平板中心接种直径5 mm的F. graminearum菌株，在28 ℃恒温培养箱中培养5 d。所有处理重复3次。测量F. graminearum菌落的直径。抑制率计算如式（1） ：
抑制率（%）=（C-E）/C×100
式中，C是对照菌落的直径，E是处理菌落的直径。
1.2.2.3 DON产生率测定
为研究B. velezensis SX1302对禾谷镰刀菌DON产生率的影响，将10 g健康干燥的小麦籽粒灭菌后，与1 mL F. graminearum 分生孢子悬浮液混合，置于100 mL锥形瓶中。分别加入3 mL B. velezensis SX1302细胞悬浮液、无细胞上清液和加热后的无细胞上清液，以3 mL无菌水作为对照。所有处理设3次重复。小麦籽粒28 ℃培养20 d后，用液氮研磨。随后，加入25 mL 84%的甲醇水溶液，振荡2 h，12 000 r/min离心10 min，收集上清液并再次提取残留物，合并两次上清液，用0.22 μm过滤膜过滤。采用高效液相色谱法（HPLC）检测DON含量。色谱柱为Kromasil C18色谱柱，流动相为80%甲醇水溶液，流速为1 mL/min，检测波长为218 nm。峰面积用于计算抑制率。
1.3 小麦赤霉病田间防治试验
田间试验于2023年在安徽科技学院种植基地进行。小区面积6 m2（2 m×3 m），采用随机区组设计，每个处理3个重复。采用PBS缓冲液，分别制备F. graminearum悬浮液（5×105分生孢子/mL）和B. velezensis SX1302菌悬液（108 CFU/mL）。在小麦扬花期，采用空气喷雾器，将200 mL F. graminearum分生孢子悬浮液均匀喷洒处理麦穗。随后，处理组喷洒200 mL B. velezensis SX1302菌悬液，对照组喷洒200 mL PBS溶液。接种后立即用塑料薄膜覆盖，3 d后揭开塑料薄膜。接种21 d后，调查所有试验区，计算小麦赤霉病病害发生率；每小区选取300个麦穗，统计发病严重程度，计算病情指数。计算如式（2 ）～（4 ）。
发病率（%）=发病麦穗数/总麦穗数×100
发病程度（%）=小麦病粒数/小麦总粒数×100
病情指数=发病率×发病程度/100
1.4 B. velezensis SX1302的促生特性及对小麦生长的影响
1.4.1 促生特性
1.4.2 对小麦生长的影响
挑选健康饱满的小麦种子，经表面消毒（70%乙醇浸泡8～10 min，1%次氯酸钠浸泡5 min）和无菌蒸馏水冲洗，转移至无菌烧杯中，利用纱布保湿保温。烧杯放入37 ℃培养箱培养2～3 d。待大部分种子露白后，挑选60粒长势健壮均一的小麦种子进行下一步试验。挑选出来的小麦种子分为2组，每组30粒。处理组用100 mL浓度为108 CFU/mL的B. velezensis SX1302细胞悬浮液浸泡24 h，对照组采用100 mL无菌水浸泡24 h。浸泡结束后，将对照组和处理组小麦种子播种于花盆中（上口径20 cm，下口径12 cm，盆高14 cm，每盆装500 g营养土，150 g珍珠岩，100 mL水）。每盆放入5粒种子，置于25 ℃温室中培养，昼夜光周期为16∶8，试验期间根据小麦生长情况及时补充水分。培养30 d后，取样，分别测定处理组和对照组小麦苗的根长、茎高、全株鲜重。随后将小麦苗于80 ℃烘干至恒重，称量干重。
1.5 数据处理
所有数据均采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 对F. graminearum的拮抗作用
2.1.1 平板拮抗试验
由图1可知，B. velezensis SX1302在培养5 d后表现出明显的拮抗活性。与对照相比，接种B. velezensis SX1302的F. graminearum无法正常外延生长布满全皿，出现明显的抑菌带。这说明B. velezensis SX1302明显抑制了禾谷镰刀菌菌丝的生长。
2.1.2 生长抑制效果
由表1可知，菌株细胞悬浮液、无细胞上清液、热处理无细胞上清液对禾谷镰刀菌孢子萌发、菌丝生长和DON产量均有明显的抑制作用，表现出良好的生防潜力。其中，细胞悬浮液、无细胞上清液、热处理无细胞上清液均可以100%抑制孢子萌发，对DON生成抑制率分别为86.89%，82.86%和75.30%。无细胞上清液和热处理无细胞上清液的拮抗效果基本一致，这说明B. velezensis SX1302上清液中的拮抗化合物具有热稳定性，121 ℃高温处理下不会失活。此外，细胞裂解内容物对孢子萌发抑制率和菌丝生长也表现出一定的抑制率，分别为21.10%和18.75%，与细胞悬浮液、无细胞上清液和热处理无细胞上清液差异均具有统计学意义（P<0.05），说明该菌株起拮抗效果的物质在胞内的存在较少，主要存在于培养上清液中。
表1 B. velezensis SX1302培养物不同组分对F. graminearum生长的抑制效果 (%) |
| 处理 | 孢子萌发抑制率 | 菌丝生长抑制率 | DON生成抑制率 |
|---|---|---|---|
| 细胞悬浮液 | 100 a | 68.75±3.31 a | 86.89±3.54 a |
| 无细胞上清液 | 100 a | 36.25±7.81 b | 82.86±2.38 a |
| 热处理无细胞上清液 | 100 a | 36.25±2.50 b | 75.30±1.64 b |
| 细胞裂解内容物 | 21.10±2.67 b | 18.75±4.51 c |
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2.2 对田间小麦赤霉病发生的防治作用
由表2可知，接种B. velezensis SX1302后，小麦赤霉病发病率为9.20%，与对照相比，发病率降低了15.20个百分点，且差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，接种B. velezensis SX1302可以降低小麦赤霉病病情指数，与对照相比，小麦赤霉病病情指数降低了65.8%，且差异具有统计学意义（P<0.05）。说明B. velezensis SX1302发酵液对小麦赤霉病有较好的防治效果，增强了小麦对赤霉病的抗性，具有良好的田间应用前景。
表2 B. velezensis SX1302对田间小麦赤霉病的防治效果 |
| 分组 | 发病率/% | 病情指数 |
|---|---|---|
| 对照 | 24.40±6.78 a | 47.6±12.3 a |
| 处理 | 9.20±4.71 b | 16.3±5.8 b |
2.3 促生特性及对小麦生长的影响
2.3.1 促生特性
该菌株不能产生HCN和铁载体，但是可以合成吲哚乙酸（IAA），并具有溶磷作用和ACC脱氨酶活性，说明该菌株具有较好的促生长潜力。
2.3.2 对小麦生长的影响
3 结论与讨论
生物防治法作为小麦赤霉病化学防治手段的有益补充，受到越来越多关注。研究人员从不同生境中分离得到对禾谷镰刀菌具有拮抗作用的菌株，包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、奇异变形杆菌和微白黄链霉菌等[4,11]。贝莱斯芽孢杆菌是一种嗜温好氧细菌，在自然界中，尤其是土壤中广泛存在，因其抗逆性强、繁殖速度快、安全性高且对人畜无害等特点，适宜作生物防治菌种[17]。王文肖等[10]研究了贝莱斯芽孢杆菌EA19与多菌灵复配对小麦赤霉病的防效，结果表明，该菌株冻干粉与多菌灵联合施用，可使多菌灵在减量30%的同时，防效不受影响，具有良好的协同防治效果。曹荣耀等[18]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌能够抑制禾谷镰刀菌的生长，且该菌的培养上清液对禾谷镰刀菌具有较好的拮抗效果，但加热处理后拮抗性能显著降低。本研究结果表明，B. velezensis SX1302能抑制禾谷镰刀菌的生长和小麦赤霉病的发生，并且抑制禾谷镰刀菌生长的活性物质具有热稳定性，121 ℃加热处理并不能降低其活性，可能是一种耐热的酶或者其他活性分子。贝莱斯芽孢杆菌已被应用于抑制病原真菌或细菌生长，但起拮抗作用的相关化合物暂不清楚。Gao等[19]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌对病原菌杀鲑气单胞菌具有较强的抑制作用，且抑菌相关物质具有耐热性。王冲等[20]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌Vel-HNGD-F2能够产生多种脂肽类物质，这些物质对禾谷镰刀菌具有较好的防治作用，且具有良好的耐热性，对紫外照射不敏感。本研究中，121 ℃加热处理无细胞上清液并不能降低其抑菌活性，说明菌株B.velezensis SX1302产生的抑菌活性物质可能并不止一种，并且起主要抑菌作用的活性物质具有良好的耐热性。
IAA作为重要的植物生长素，在调控植物生长发育过程中起着关键作用[22-23]。在本研究中，菌株B. velezensis SX1302能产生IAA，同时还具有ACC脱氨酶活性。ACC脱氨酶可以消耗乙烯前体ACC，从而降低植物体内胁迫乙烯的水平[24-25]。因此，B.velezensis SX1302具有改善植物生长的潜力。盆栽试验结果也验证了这一点，菌株B. velezensis SX1302处理的小麦的根长、茎高、鲜重和干重均明显增加。Meng等[26]在盆栽试验中使用B. velezensis BAC03 接种包括小麦在内的9种不同植物，结果表明，植物的生长均得到了促进，其促进效果因植物种类而异。
综上，本研究探究了小麦赤霉病拮抗菌B. velezensis SX1302的拮抗活性及防治效果，结果表明，B. velezensis SX1302明显抑制禾谷镰刀菌的生长，且抑制生长的活性物质具有热稳定性；B. velezensis SX1302对小麦赤霉病有较好的防治效果，增强了小麦对赤霉病的抗性，具有良好的田间应用前景；B. velezensis SX1302可以合成IAA，具有溶磷作用和ACC脱氨酶活性，对小麦的生长具有促进作用。本研究为开发基于B. velezensis SX1302菌株的生物防治剂提供参考。