玉米茎基腐病拮抗菌的筛选及系统发育分析

王艳; 马军; 唐荣阳; 刘楠; 胡冰清; 谭小川; 聂春雨; 殷亚杰

doi:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.11.018

安徽农学通报 >

2025 , Vol. 31 >Issue 11: 81 - 85

DOI: https://doi.org/10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.11.018

生态环境·植保

玉米茎基腐病拮抗菌的筛选及系统发育分析

王艳 ¹ ,
马军 ² ,
唐荣阳 ¹ ,
刘楠 ¹ ,
胡冰清 ¹ ,
谭小川 ¹ ,
聂春雨 ¹^,³ ,
殷亚杰 ¹^,³

展开

^1. 大庆师范学院生物工程学院，黑龙江大庆 163712
^2. 黑龙江省农业科学院经济作物研究所，黑龙江哈尔滨 150086
^3. 黑龙江省油田应用化学与技术重点实验室，黑龙江大庆 163712

殷亚杰（1978—），男，内蒙古赤峰人，博士，教授，从事土壤生态学研究。

王艳（2004—），女，河南郑州人，从事土壤生态学研究。

Copy editor: 何艳

收稿日期: 2024-11-13

网络出版日期: 2025-06-16

基金资助

黑龙江省大学生创新创业训练计划项目(S202410235069)

收起

Screening and phylogenetic analysis of antagonistic bacteria against maize stalk rot

WANG Yan ¹ ,
MA Jun ² ,
TANG Rongyang ¹ ,
LIU Nan ¹ ,
HU Bingqing ¹ ,
TAN Xiaochuan ¹ ,
NIE Chunyu ¹^,³ ,
YIN Yajie ¹^,³

Expand

^1. School of Biological engineering, Daqing Normal College, Daqing 163712, China
^2. Economic Crop Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
^3. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Oilfield Applied Chemistry and Technology, Daqing 163712, China

Received date: 2024-11-13

Online published: 2025-06-16

Fold

摘要

为筛选出玉米茎基腐病病原菌（Fusarium graminearum）的拮抗菌，采用纯培养技术对来自4个地区土壤样本中的微生物进行分离，通过平板拮抗试验，对分离菌株进行筛选，并对拮抗菌株进行生理生化特性（包括碳源代谢、酶活性等）及分子鉴定。结果表明，4个地区土壤中可培养微生物多样性分布存在差异，其中广东地区各样地土壤微生物菌群更丰富。从4个地区的土壤中共筛选出129株细菌，其中革兰氏阳性菌株100株，阴性菌株29株，形态多为杆状。通过平板拮抗试验，从129株细菌中筛选出11株对玉米茎基腐病具有拮抗作用的细菌。生理生化指标测定结果表明，各拮抗菌株在代谢类型、酶活性及革兰氏属性上存在显著差异，但部分指标（如β-半乳糖苷酶试验、有机磷解磷试验）表现出高度一致性。系统发育分析结果表明，对玉米茎基腐病具有较强拮抗活性的菌株包括洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）、泛菌属（Pantoea）和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei），系统进化发育分析显示霍氏肠杆菌属和泛菌属亲缘关系较近。综上，本试验筛选鉴定出伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）、泛菌属（Pantoea）和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）菌株，对Fusarium graminearum具有较强的拮抗作用，具有开发生防菌的潜力。

关键词： 玉米茎基腐病; 生物防治; 拮抗微生物; 平板对峙; 系统发育

本文引用格式

王艳 , 马军 , 唐荣阳 , 刘楠 , 胡冰清 , 谭小川 , 聂春雨 , 殷亚杰 . 玉米茎基腐病拮抗菌的筛选及系统发育分析[J]. 安徽农学通报, 2025 , 31(11) : 81 -85 . DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.11.018

Abstract

To screen out the antagonistic bacteria of the maize stalk rot pathogen (Fusarium graminearum), pure culture techniques were used to isolate microorganisms from soil samples collected from 4 regions. Isolated strains were screened via plate antagonism assays, and the antagonistic strains were further characterized by their physiological and biochemical properties (including carbon source metabolism, enzyme activity, etc.) and subjected to molecular identification. The results indicated that there were differences in the diversity distribution of culturable microorganisms in the soils of the four regions, among which the microbial communities in the soils of various plots in Guangdong Province were more diverse. A total of 129 bacterial strains were isolated from the soil samples of the 4 regions, including 100 Gram-positive strains and 29 Gram negative strains, with most displaying rod-shaped morphology. Through plate confrontation assays, 11 bacterial strains with antagonistic activity against maize stalk rot were screened from the 129 isolates. Physiological and biochemical characterization revealed significant differences among the antagonistic strains in metabolic patterns, enzyme activities, and Gram properties, although some indicators (e.g., ONPG test, organic phosphorus solubilization test) showed high consistency. The results of phylogenetic analysis indicate that strains with strong antagonistic activity against maize stalk rot included Burkholderia cepacia, Pantoea, and Enterobacter hormaechei. Phylogenetic analysis demonstrated a close genetic relationship between Enterobacter hormaechei and Pantoea. In conclusion, this study successfully screened and identified strains of Burkholderia cepacia, Pantoea, and Enterobacter hormaechei, which exhibit strong antagonistic activity against maize stalk rot (Fusarium graminearum), showing potential for development as biocontrol agents.

Key words： maize stalk rot; biological control; antagonistic microorganisms; plate confrontation; phylogeny

茎基腐病是常见的作物土传病害之一，其在田间可通过雨水、灌溉水以及农具等进行传播，可导致作物产量和品质下降^[1]。该病害的分布范围较广，已在多个地区被报道^[2-3]。玉米茎基腐病的病原菌种类繁多，主要包括镰孢菌属（Fusarium）和腐霉菌属（Pythium）。目前，化学防治是该病害的主要防治方法，但该防治方法可能会对后茬作物产生毒害作用，同时威胁土壤生态系统平衡和土壤资源的可持续利用。相比之下，生物防治被认为是一种更为有效的防治方法。张丹丹^[4]和贺小伦等^[5]研究发现，玉米茎基腐病和小麦茎基腐病的致病菌主要为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、假禾谷镰刀菌（Fusarium pseudograminearum）、小麦根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）、层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）和腐霉菌（Pythium spp.）等，其拮抗菌多为芽孢杆菌属（Bacillus）及假单胞菌属（Pseudomonas）。

本研究通过纯培养技术，对吉林、广东、河南和西藏4个地区3种不同土地利用类型（长期种植玉米地、施用农药和化肥耕地、未开垦土地）的表层（0～10 cm）和深层（10～20 cm）土壤微生物进行筛选与纯化。利用平板对峙试验，筛选出具有生防潜力的细菌菌株，并从生理生化特性和分子生物学两个维度对其特征进行鉴定，以明确其系统分类地位和进化关系。此外，结合室内盆栽试验，验证其生防效果，为不同地区玉米茎基腐病的防治及其农药研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 土壤采集

土壤样品采自广东（113°1'74″ E，23°4'38″ N）、河南（113°1'24″ E，34°2'42″ N）、吉林（125°3'76″ E，42°3'05″ N）、西藏（88°9'39″ E，29°2'45″ N）4个地区3类具有代表性的样地，即长期种植玉米地（A样地）、施用农药和化肥耕地（B样地）以及未开垦土地（C样地）。于2024年春季，采用五点法采集表层（0～10 cm）和深层（10～20 cm）土壤。

1.2 供试材料

1.2.1 培养基和病原菌株

本研究采用的培养基包括营养琼脂培养基^[6]、LB培养基、PDA培养基、PCA培养基和高氏培养基^[7]。玉米茎基腐病病原菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）由大庆师范学院生物实验室提供。

1.2.2 仪器设备

洁净工作台（BCN-1360，北京成萌伟业科技有限公司）、水浴锅（HH-6，上海捷呈实验仪器有限公司）、数码显微镜（ME21，广州市明美光电技术有限公司）、PCR仪（9700，赛默飞世尔科技中国有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（SX-700，TOMY公司）、恒温摇床（YF3200，上海量壹科学仪器有限公司）、数显电热鼓风干燥箱（A201386，上海艾测电子科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤微生物分离与形态观察

（1）土壤微生物平板计数（PCA计数法）。将待测样品进行密度梯度稀释，使微生物分散成单个细胞并进行平板涂布，培养48 h后进行菌落计数^[8]。（2）微生物菌株分离纯化。挑选形态特征明显的单菌落，利用三区划线方法进行分离纯化^[9]。（3）微生物形态学特征观察。选取形态特征明显的单菌落进行革兰氏染色，使用油镜观察染色结果^[10]。

1.3.2 拮抗菌株筛选

通过平板对峙试验，筛选出对禾谷镰刀菌具有拮抗作用的微生物菌株。以玉米茎基腐病病原菌禾谷镰刀菌为指示菌，PDA培养基为检测平板，采用点接法将筛选得到的菌株接种于PDA平板四周，每个平板接种4种菌株，在平板中央接种指示病原菌并做好标记。随后将平板放入30 ℃恒温培养箱内进行培养。待指示菌株覆盖平板后进行结果观察，若筛选出的菌株周围出现明显的抑菌圈，则表明该菌株具有抑菌效果^[11]。

1.3.3 拮抗菌株的生理生化鉴定

对筛选的拮抗菌株进行革兰氏染色^[12]、葡萄糖发酵（HL）、脲酶、甲基红（MR）、伏普（VP）、β-半乳糖苷酶（ONPG）、硫化氢生成（HS）、淀粉水解、解磷（有机磷、无机磷）和吲哚试验共11项生理生化鉴定试验^[12]。

1.3.4 拮抗菌株分子鉴定

取2 mL离心管，加入200 µL预处理液和少许玻璃珠，加入适量拮抗菌样品，放入研磨仪中充分研磨；加入20 µL Proteinase K，200 µL裂解液，充分混匀，于70 ℃条件下放置10 min；加入无水乙醇，充分混匀后离心；混合物过吸附柱，洗涤液洗1次，漂洗液洗2次；吸附柱在室温下放置3～5 min，以确保吸附柱中残余的漂洗液完全挥发；加无菌水溶解，离心收集溶液至离心管中，获得菌株基因组DNA。对菌株16S rDNA序列进行扩增并测序。测序结果通过NCBI-Blast软件进行同源性分析，并采用MEGA 11.0.13软件构建基于邻接法和最大似然法的系统进化树（Bootstrap值设定为1 000次）。

2 结果与分析

2.1 不同地区土壤中可培养微生物的多样性分布

由表1可知，广东地区A、C样地随着土壤深度的增加平均菌落数增加，B样地随着土壤深度的增加平均菌落数减少；河南地区A、C样地随着土壤深度的增加平均菌落数减少，B样地随着土壤深度的增加平均菌落数增加；吉林地区A、B样地随着土壤深度的增加平均菌落数减少，C样地随着土壤深度的增加平均菌落数增加；西藏地区A、C样地随着土壤深度的增加平均菌落数减少，B样地随着土壤深度的增加平均菌落数增加。综合来看，4个地区土壤中可培养微生物多样性分布存在差异，其中广东各样地土壤微生物菌群更丰富。

表1 不同地区土壤样品PCA培养48 h的菌落计数结果

取样地点	土层深度/cm	统计平板数（N）	平均菌落数/（cfu/10 g）
取样地点	土层深度/cm	统计平板数（N）	广东	河南	吉林	西藏
A	0～10	3	93.37	41.00	64.33	4.33
A	10～20	3	222.28	15.00	1.00	2.00

B	0～10	3	116.46	20.33	19.33	4.33
B	10～20	3	91.00	22.00	1.00	5.96

C	0～10	3	93.05	15.00	1.00	4.34
C	10～20	3	317.49	2.00	2.00	3.87

2.2 微生物的分离纯化及拮抗菌株筛选

本研究共筛选出细菌129株（广东采样点59株、河南采样点30株、西藏采样点21株、吉林采样点19株），其中革兰氏阳性菌株100株，阴性菌株29株。通过平板对峙试验筛选出对玉米茎基腐病具有拮抗作用的菌株11株（图1）。

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图1 拮抗菌株照片比较

2.3 拮抗菌株的生理生化鉴定

为进一步掌握拮抗菌株的生理生化特性，对11株拮抗菌株进行11项生理生化指标检测（表2），包括碳源代谢（葡萄糖发酵）、酶活性（脲酶、硫化氢产生、淀粉水解等）、代谢产物（甲基红、伏普试验）、磷素利用（无机磷/有机磷解磷）及革兰氏染色等。结果显示，各菌株在代谢类型、酶活性及革兰氏属性上存在显著差异，但部分指标（如ONPG试验、有机磷解磷试验）表现出高度一致性。

表2 拮抗菌株的生理生化鉴定结果

菌株序号	葡萄糖发酵试验	脲酶试验	甲基红试验	伏普试验	ONPG 试验	硫化氢试验	淀粉水解试验	革兰氏染色试验	无机磷解磷试验	有机磷解磷试验	吲哚试验
4	氧化型	－	－	+	－	+	+	－	－	－	+
22	发酵型	+	+	+	－	－	+	+	－	－	+
26	发酵型	－	+	+	－	－	+	+	－	－	+
28	产碱型	－	－	－	－	－	－	+	+	－	－
29	发酵型	+	－	+	－	－	－	－	－	－	－
30	氧化型	－	－	－	－	+	－	－	－	－	+
40	发酵型	－	+	+	－	－	－	+	－	－	+
46	发酵型	－	－	－	－	－	+	+	－	－	+
60	氧化型	－	+	－	－	－	+	+	+	－	+
69	发酵型	+	－	+	－	+	－	+	－	－	－
118	发酵型	－	－	+	－	－	－	+	－	－	+

注：+表示阳性，－表示阴性。

碳源代谢方面，葡萄糖发酵类型是反映菌株代谢途径的核心指标。结果显示，发酵型菌株数量最多，共7株，表明多数菌株可通过发酵途径利用葡萄糖；氧化型菌株数量次之，共3株，推测其依赖氧化途径代谢葡萄糖；仅1株（28号）为产碱型，可能通过产碱反应调节土壤pH。

酶活性方面，脲酶试验，仅22、29、69号菌株呈阳性，表明多数菌株不具备分解尿素产生氨的能力；硫化氢试验，仅4、30、69号菌株呈阳性，表明这3株菌株可能通过含硫氨基酸（如半胱氨酸）代谢产生硫化氢；淀粉水解试验，4、22、26、46、60号菌株呈阳性，说明其可分泌淀粉酶分解淀粉；吲哚试验，除28、29、69号外，其余8株菌株均呈阳性，表明多数菌株能通过色氨酸酶分解色氨酸产生吲哚^[13]。

代谢产物（甲基红试验、伏普试验），甲基红试验（MR试验）阳性菌株为22、26、40、60号，表明这4株菌株发酵葡萄糖后产酸能力较强；伏普试验（V-P试验）阳性菌株为4、22、26、29、69、118号，表明这些菌株具有完整的色氨酸酶系统，能够将色氨酸分解为吲哚、丙酮酸和氨。甲基红试验与伏普试验联用，能够全面分析细菌的糖代谢特性。

磷素利用能力，无机磷解磷试验，仅28、60号菌株呈阳性，表明这两株菌具备分解无机磷的能力，可能对土壤磷素活化有潜在应用价值^[14]；有机磷解磷试验中所有菌株均呈阴性，说明供试菌株无法通过分泌植酸酶等分解有机磷。

2.4 拮抗菌株的分子鉴定

对平板拮抗试验中拮抗性较强的3株菌株（抑菌圈直径较大）进行分子鉴定，菌株基因组DNA提取检测结果如图2所示。通过构建菌株的16S rDNA序列系统进化树，发现4号菌株与洋葱伯克霍尔德氏菌GalA64（Burkholderia cepacia）同源性高达99.93%；118号菌株与泛菌（Pantoea）同源性高达99.79%；30号菌株与霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）同源性高达100%。结合菌株的形态学特征、生理生化特性和16S rDNA系统发育树，最终确定4号菌株为洋葱伯克霍尔德菌，30号菌株为霍氏肠杆菌，118号菌株为泛菌。系统发育树（图3~4）分析结果揭示这3株拮抗菌株归属于2个不同的分支。

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图2 拮抗菌株基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳

M从上到下依次为5 000、3 000、2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

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图3 相邻连接法进化树

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图4 最大似然系统法发育树

3 结论与讨论

土壤微生物数量庞大，种类繁多，在物质循环以及能量流动中发挥重要作用，其多样性与环境因子的关系逐渐成为研究的焦点^[15]。目前，微生物群落多样性的研究方法主要有显微镜观察法、PCR扩增和高通量测序技术、土壤生物多样性监测以及环境DNA技术等。本研究利用了显微镜观察法和PCR扩增法，对土壤微生物多样性进行分析。通过纯培养技术，筛出129株菌株（广东采样点59株、河南采样点30株、西藏采样点21株、吉林采样点19株），结合广东地区平均温度高于北方地区的特点，推断土壤微生物的生长受温度影响明显。

拮抗作用是生物防治的一种策略，生防菌通过产生抗生素等物质，抑制病原物的生长和代谢^[16]。在当前生防细菌研究中，以内生性生防细菌研究居多，内生性生防细菌能够在寄主体内产生与寄主相似的活性物质或活性物质前体。其中，有关芽孢杆菌的研究尤为突出，Genbank等基因数据库中已收录大量已知序列，为基因检索和序列比对提供了丰富的资源，这些资源包括大量微生物基因组和保守序列。Huang等^[17]分别于实验室、温室、大田环境下调查洋葱伯克霍尔德氏菌对假禾谷镰刀菌的生防效果，在室内抑菌测定试验中，洋葱伯克霍尔德氏菌可对假禾谷镰刀菌表现出明显的抑菌作用，通过显微镜观察，发现与细菌接触的真菌菌丝细胞普遍发生溶解现象。据此推断，洋葱伯克霍尔德氏菌产生的抗生素物质对假禾谷镰刀菌菌丝生长具有较强的抑制作用。此外，该细菌对玉米茎基腐病致病菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）亦表现出一定的拮抗作用^[18]。

本研究通过对不同生境土壤样品中的微生物进行培养和分离，获得129株纯化菌株，其中革兰氏阳性菌株100株，阴性菌株29株。利用平板对峙法筛选出对禾谷镰刀菌具有拮抗作用的菌株11株。进一步对拮抗效果较强的3株菌株进行种属鉴定，成功拼接出3株菌株的16S rDNA序列。通过与NCBI数据库对比，并利用MAGE 11.0.13软件构建系统进化树，最终确定这3株菌株分别为伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）、泛菌属（Pantoea）和霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）。

参考文献

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1 材料与方法

1.1 土壤采集

1.2 供试材料

1.2.1 培养基和病原菌株

1.2.2 仪器设备

1.3 试验方法

1.3.1 土壤微生物分离与形态观察

1.3.2 拮抗菌株筛选

1.3.3 拮抗菌株的生理生化鉴定

1.3.4 拮抗菌株分子鉴定

2 结果与分析

2.1 不同地区土壤中可培养微生物的多样性分布

表1 不同地区土壤样品PCA培养48 h的菌落计数结果

2.2 微生物的分离纯化及拮抗菌株筛选

图1 拮抗菌株照片比较

2.3 拮抗菌株的生理生化鉴定

表2 拮抗菌株的生理生化鉴定结果

2.4 拮抗菌株的分子鉴定

图2 拮抗菌株基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳

图3 相邻连接法进化树

图4 最大似然系统法发育树

3 结论与讨论

参考文献