烤烟作为重要的经济作物之一，对稳定烟农收入、促进农业产业结构优化等具有重要意义。烟草赤星病是烟草种植区普遍发生的病害[1]。该病害是由子囊菌亚门链格孢属侵染引起的一种真菌性病害[2]，常在烟叶成熟期发病，烤烟叶部是其主要为害部位，对烟叶的产量和品质具有不利影响。严重时发病率达90%，减少产值达50%以上[3]。受感染烟株通常先在叶片的下表皮开始出现褐色同心轮纹斑症状，逐渐向上扩大，同时感染周围健康烟叶组织。常年连作烟草植株的烟田中，该病害可以大面积流行成灾，严重时可使烟产地区整年无经济收成[4]。目前，防治烟草赤星病的方法以化学防治为主，但部分化学药剂会对环境造成污染，对人畜的安全造成一定危害，可能对烤烟的品质也具有一定影响。为破解化学防治的上述困境、实现烟草绿色安全生产，开发环境友好、安全性高的生物防治技术成为烟草赤星病防控研究的重要方向。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试病原菌是从贵州省遵义市湄潭县永兴镇梅家林村烟田烟叶中成功分离鉴定的烟草赤星病菌株。供试放线菌来源于研究区有烟草赤星病病株发生的烟田中健康烟株根围土壤。
供试培养基配方参考《植病研究方法》[7]，烟草赤星病病原菌的分离、纯化、扩大培养和平板对峙培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），即去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉20 g、加入无菌水定容到1 000 mL。土壤放线菌的分离所用培养基为高氏合成1号培养基，即可溶性淀粉20 g、NaCl 0.5 g、KNO3 1 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂15～25 g、无菌水1 000 mL。放线菌纯化和培养所用培养基为燕麦培养基，即燕麦片30 g、琼脂17～20 g、无菌水1 000 mL。
1.2 烟草赤星病病原菌形态学特征
利用组织分离法[7]将田间采集到的烟草赤星病标本带回实验室，选择具有褐色同心轮纹斑症状的烟草植株叶片制成临时装片，在显微镜下观察其特征。将检测过的发病病叶置于清水中，清洗后置于超净台上，用无菌的解剖剪剪取病健交接部位的叶片组织（0.5 cm×0.5 cm），用75%的酒精进行叶片表面处理10～15 s，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸中吸收叶片表面多余的水分，以减少污染。将叶片组织病害处紧贴于PDA培养基中，每个培养基放三块且呈三角形分布，然后放置在28 ℃恒温培养箱中培养3 d，待长出菌落后挑取单菌落边缘一定量的病原菌丝进行纯化，观察其在PDA培养基中的特征。
1.3 土壤采集
从研究区选取健壮且长势良好的健康烟草植株根围的土壤，先除掉5～10 cm深度的土壤、枯枝和落叶等，将在五点采集到的土壤充分混匀，装入准备好的牛皮纸袋中做好标记，带至实验室，每块烟田采集1份土壤，共采集10份。
1.4 放线菌的分离及初步鉴定
1.4.1 放线菌分离培养
采用稀释平板分离法对土壤中的放线菌进行分离。土壤在干燥无菌的地方晾7 d后，称取土样10 g。在超净台上，将土样放入装有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，置于摇床震荡20 min后，静置20～30 s，作为10-1土壤稀释液；吸取10-1土壤稀释液1 mL，移入装有9 mL无菌水的试管中，混匀、稀释，为10-2土壤稀释液。以此类推，制备10-3和10-4土壤稀释液。分别取0.1 mL土壤稀释液分散地放于高氏合成1号培养基中，用玻璃涂布棒在培养基表面涂布均匀。放置20 min后，倒置于32 ℃培养箱培养7 d。待菌落形成后用灭菌后的牙签小心挑取，菌体为圆形、较小，菌落表面干燥、坚硬，将菌体转移至新的高氏合成1号培养基上培养1～7 d。
1.4.2 放线菌的形态学特征观察
在高氏合成1号培养基上培养1～7 d后，观察菌落的生长特征，放线菌菌落生长速度缓慢，一般生长到第7天菌落就不再扩大，菌丝相互交错缠绕，形成的菌落质地硬且致密，表面坚实、干燥、多皱，到后期表面呈现絮状、粉末状、颗粒状的典型放线菌菌落，有气生菌丝和基生菌丝，且菌落的正反面常呈现不同的颜色[8]。利用插片培养法[9]在显微镜下观察是否有孢子链和孢子产生。采用高氏合成1号培养基，将无菌盖玻片以45°左右的角度并排插入平板培养基中，插入深度为盖片的1/3左右，用无菌接种环挑取放线菌孢子悬液，接种于盖玻片与琼脂培养基的交界线上。在32 ℃下培养3 d左右，悬液不宜过浓，接种量不宜过大，培养时间也不宜过长，否则菌丝过密影响观察。
1.5 拮抗放线菌的筛选
使用平板对峙法筛选拮抗放线菌，用灭菌的牙签在待测放线菌菌落上挑取少量放线菌菌体接种于PDA培养基直径的1/4处，倒放在32 ℃恒温培养箱中培养7 d，用无菌打孔器打取直径为5 mm的烟草赤星病病原菌菌饼放置于生长有放线菌的PDA培养基另一侧的1/4处，形成对峙培养的状态。以只接种烟草赤星病病原菌的PDA平板为对照（CK）。每个处理3个重复。
1.6 测定指标及方法
采用十字交叉法取平均值的方法测量菌落直径。对峙培养第3天至第7天，每天定时测量一次烟草赤星病病原菌的生长直径。利用抑菌直径衡量放线菌对烟草赤星病的抑制效果。利用培养5 d抑菌直径的平均值表示拮抗放线菌的总体抑制水平；连续5 d抑菌直径的发展趋势表示拮抗放线菌对病原菌的抑制持续强度的强弱；第7天的抑菌直径表示拮抗放线菌抑制作用的稳定性。抑菌直径和平均抑菌直径计算如式（1 ）～（2 ）。
抑菌直径=空白对照组中的病原菌菌落直径－放线菌对峙培养基中病原菌菌落的直径
平均抑菌直径=各重复抑菌直径之和/3
2 结果与分析
2.1 烟草赤星病病原菌形态学特征
2.2 烟草根围土壤放线菌的形态学特征
试验从健康烟草根围10份土壤中获得59株放线菌。部分纯化的放线菌如图2所示，分离出的放线菌在燕麦培养基上的菌落颜色丰富，菌丝结合紧密，菌落正面和背面呈不同颜色。
2.3 拮抗放线菌筛选
如图3所示，通过平板对峙法，发现7株放线菌对烟草赤星病病原菌均具有明显的抑制作用，其中YF-33、YF-49和YF-5的抑制效果较好。如表1所示，7株放线菌连续测量5 d的平均抑菌直径大小依次为YF-33（20.46 mm）>YF-49（15.12 mm）>YF-5（14.60 mm）>YF-1（11.76 mm）>YF-48（11.22 mm）>YF-41（9.64 mm）>YF-55（9.44 mm）；其中YF-33、YF-49和YF-5连续5 d的抑菌直径呈持续增长趋势，且第7天的抑菌直径分别为23.13、16.33、17.33 mm。综合表明，YF-33、YF-49和YF-5拮抗效果好、稳定且抑制持续时间长。
表1 7种拮抗放线菌对烟草赤星病病原菌平均抑菌直径 (mm) |
| 放线菌编号 | 对峙时间 | 平均值 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 3 d | 4 d | 5 d | 6 d | 7 d | ||
| YF-33 | 17.83 | 19.33 | 20.97 | 21.03 | 23.13 | 20.46 |
| YF-49 | 12.47 | 14.83 | 15.83 | 16.13 | 16.33 | 15.12 |
| YF-5 | 11.67 | 12.83 | 14.83 | 16.33 | 17.33 | 14.60 |
| YF-1 | 11.33 | 11.33 | 12.03 | 9.97 | 14.13 | 11.76 |
| YF-48 | 8.83 | 11.03 | 9.37 | 12.73 | 14.13 | 11.22 |
| YF-41 | 9.63 | 10.03 | 9.33 | 7.37 | 11.83 | 9.64 |
| YF-55 | 7.33 | 7.83 | 11.33 | 9.17 | 11.53 | 9.44 |
| CK | 43.33 | 52.33 | 59.33 | 60.17 | 66.83 | 56.40 |
3 结论与讨论
综上，本研究从健康烟草根围10份土壤中获得59株放线菌，筛选出7株对烟草赤星病病原菌有抑制作用的放线菌，其中YF-33、YF-49和YF-5拮抗效果较好、稳定且抑制持续时间长。研究结果为拮抗放线菌在防治烟草赤星病中的应用提供参考。今后将对7株拮抗放线菌的生物防治机制、繁殖工艺和田间防治效果进行进一步研究。