葡萄是重要的经济类果树之一，市场对鲜食葡萄和酿酒葡萄的需求量较大，其果实品质受到行业与市场的广泛关注[1]。‘赤霞珠’葡萄是酿造高品质红葡萄酒的主要原料，花色苷是决定葡萄与葡萄酒色泽的关键物质，其不仅赋予果实鲜艳颜色，还会影响葡萄酒的风味、口感及陈酿特性。作为苯丙烷—类黄酮代谢途径的关键终端产物，花色苷的合成始于苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙氨酸转化为肉桂酸，随后经查尔酮合成酶（CHS）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）等酶促反应生成无色花青素，最终由花青素合成酶（ANS）和尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶（UFGT）修饰形成稳定结构[2]。此外，花色苷能清除自由基和活性氧，具有改善视力、预防心血管疾病、调节血糖、保护神经、抗菌消炎和保护肠道等功能[3]。
在农业生产中，干旱是主要的农业气象灾害之一，其不仅会影响农作物的生长和产量，还可能对农业生态系统和粮食安全构成威胁。干旱发生频率高、致灾范围广、持续时间长是制约酿酒葡萄产业健康可持续发展的因素之一[4]。酿酒葡萄种植区域主要集中在北方地区，其中新疆、甘肃、宁夏等地种植面积较广，然而，这些地区普遍面临淡水资源匮乏和降水量较少等问题[5]。宁夏贺兰山东麓产区是典型的酿酒葡萄优势种植区，其独特的地理条件与气候环境为酿酒葡萄生长提供了优质基础，然而，该产区干旱少雨、土地荒漠化占比高的问题制约了酿酒葡萄的规模化、高质量种植。
花色苷的合成调控机制具有多样性，其生物合成受到基因遗传的内在影响和外部环境因素的调节。Kennedy等[6]研究发现，水分的盈亏会影响葡萄类黄酮物质的积累，适度的干旱胁迫可诱导葡萄花色苷的合成。赵权等[7]研究表明，适度干旱处理能够提高山葡萄果皮花色苷的质量分数。孙磊[8]通过差异基因KEGG通路富集和表达模式分析，发现刺葡萄果皮中5GT和3AT基因分别参与花色苷的合成和酰化修饰，而GST4和AM2基因与花色苷的转运有关。
目前，关于葡萄果皮花色苷合成代谢机制的研究较多，而有关‘赤霞珠’葡萄在干旱胁迫下果实花色苷的代谢机制尚未明确。因此，本研究以‘赤霞珠’葡萄为材料，深入探讨干旱胁迫对其果实花色苷代谢的影响，为该品种葡萄品质提升、抗逆栽培提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试葡萄品种为‘赤霞珠’葡萄。
1.2 试验设计
设置正常生长无干旱胁迫对照（CK）和干旱胁迫处理（DR）2个处理组，每个处理组设置3个重复植株于6月初开始坐果，在此之后每隔14 d浇水1次，直至8月初进入转色期。CK处理在整个生长周期内（从坐果到采收）每隔14 d浇水1次；DR处理在6月初坐果至转色期内每隔14 d浇水1次，在转色期后进行干旱处理，不再进行常规浇水，直至10月初的采收期。为确保采样的代表性和试验结果的准确性，采样时兼顾果穗的阴、阳面，以及果穗的上、中、下部，随机选取果粒饱满、大小均匀的果实，带回实验室后立即置于冰箱保存备用，以供后续分析。
1.3 试验方法
利用液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS）进行代谢组测序分析，色谱条件：色谱柱，Waters ACQUITY Premier HSS T3 Column 1.8 µm，2.1 mm×100 mm；流动相A，0.1%甲酸/水；流动相B，0.1%甲酸/乙腈；仪器柱温，40 °C；流速，0.4 mL/min；进样量，4 μL；质谱下机原始数据经过ProteoWizard转换为mzXML格式，采用XCMS 程序进行峰提取、对齐，保留时间校正。首先对各组样本中缺失率超过 50% 的峰实施过滤处理，再采用KNN方法对空白值进行填充，随后运用SVR方法校正峰面积，校正筛选后的峰通过实验室自建数据库、公共数据库、预测数据库及metDNA方法检索，最终完成代谢物鉴定。QC是由样本提取物混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在仪器分析的过程中，一般每10个检测分析样本中插入一个QC，以监测分析过程的重复性。通过对不同QC质谱检测分析的总离子流图（TIC）进行重叠展示分析，可判断代谢物提取和检测的重复性。提取鉴定综合打分0.5分以上且质控样本（QC）CV值小于0.5的物质，再进行正、负模式合并，保留定性等级最高且CV值最小的物质。以P<0.05、变量投影重要性（VIP）>1作为差异代谢物筛选条件确定差异代谢物，对筛选的不同处理下差异代谢物进行KEGG通路富集分析，以确定与葡萄果实色泽相关的差异代谢物。
1.4 数据处理与分析
利用SPSS 19.0软件进行数据分析，使用Origin 2024软件制作柱状图，采用迈维云平台（https://cloud.metware.cn）进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、聚类热图分析和代谢通路分析。
2 结果与分析
2.1 代谢物的PLS-DA
PLS-DA分析表明，CK和DR处理下葡萄样品均稳定分布在95%的置信区间内，进一步证实了该模型的可靠性和准确性。主成分1（PC1）和主成分2（PC2）对总变异的贡献率分别为59.31%和21.05%，二者累计贡献率达80.36%，CK和DR处理的样本间展现出明显的分离趋势，表明样本间分类效果显著（图1）。
2.2 聚类分析
由图2A可知，在DR、CK两个处理中共检测到17种花青素差异代谢物，其中DR处理较CK处理有7种物质上调，占总花青素差异代谢物的41.18%，分别为Peonidin-3-O-alpha-arabinopyranoside（芍药素-3-O-阿拉伯糖苷）、Cyanidin 3-sambubioside 5-glucoside（矢车菊素-3-桑布双糖苷-5-葡萄糖苷氯化物）、Cyanidin 3-arabinoside cation（矢车菊素-3-O-阿拉伯糖苷）、Delphinidin 3-sambubioside（氯化飞燕草素-3-O-桑布双糖苷）、Pelargonidin 3-（6-p-coumaroyl）glucoside（天竺葵素-3-氯化葡萄糖苷）、[（3S，6S）-6-[5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxy-3，5-dimethoxyphenyl）chromenylium-3-yl]oxy-3，4，5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl（E）-3-（3，4-dihydroxyphenyl）prop-2-enoate（锦葵色素 3-O-（6''-O-p-香豆酰基葡萄糖苷）、Peonidin 3-（6''-p-coumarylglucoside）[芍药素-3-（6-O-对香豆酰）葡萄糖苷]。由图2B可知，在DR、CK两个处理中共检测到9种原花青素差异代谢物，DR较CK有6种物质上调，占总原花青素差异代谢物的66.67%，分别为Procyanidin B3（原花青素B3）、Procyanidin B4（原花青素B4）、Procyanidin B5（原花青素B5）、Procyanidin C1（原花青素C1）、Procyanidin B1（原花青素B1）、Theaflavin monogallates（茶黄素-3-没食子酸酯）。综合来看，干旱胁迫对两类物质均具有上调作用，且其对原花青素的上调效应更为明显。
2.3 花色苷代谢途径
基于以上分析结果，分析并绘制了花色苷代谢途径解析图（图3）。苯丙氨酸为起始底物，经PAL催化生成肉桂酸；肉桂酸经肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）转化为对香豆酸-CoA；对香豆酸-CoA与丙二酰-CoA在CHS作用下生成查尔酮，查尔酮经查尔酮异构酶（CHI）转化为柚皮素；柚皮素经F3H生成二氢山柰酚，再经类黄酮-3'-羟化酶/类黄酮-3'，5'-羟化酶（F3'H/F3'5H）生成二氢槲皮素/二氢杨梅素；上述产物经二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）生成无色花青素后，分成两条支路合成不同产物：花青素和原花青素。分析DR和CK的代谢物表达量发现，干旱胁迫后的葡萄花青素表达量低于CK，而原花青素在干旱胁迫后的表达量高于CK。推测干旱胁迫下花青素和原花青素合成的差异化，是植物通过次生代谢响应干旱胁迫的机制之一。
3 结论与讨论
在葡萄酒的生产实践中，葡萄果实品质是决定葡萄酒质量优劣和口感的关键因素，葡萄果实的糖分、酸度、香气成分以及色素等在一定程度上影响着葡萄酒的风味和品质[9]。然而，在葡萄生长过程中，水分胁迫是一种常见的逆境条件，其会导致植物在形态和生理生化方面出现较大变化[10]。在干旱时，植物叶片可能会出现萎蔫、变黄等现象，光合作用效率降低，呼吸作用增强，同时还会产生抗氧化酶活性变化、激素水平调节等一系列的生理生化反应。在葡萄果实色素合成过程中，花青素的合成途径尤为重要。花青素是葡萄果实中主要的色素成分之一，其赋予了葡萄果实鲜艳的颜色，同时也对葡萄酒的色泽和风味产生重要影响。在花青素的合成途径中，无色花青素是其重要的前体物质，无色花青素可通过无色花青素还原酶生成原花青素。花青素和原花青素不仅在葡萄果实的品质形成中起着重要作用，还具有多种生物活性，以及抗氧化、抗炎、调节血糖和增强免疫等功能，因此在食品、医药等领域具有巨大的潜力和广阔的应用前景[11]。
近年来，代谢组学技术在植物逆境胁迫研究中得到了广泛应用，代谢组学通过对植物代谢物的全面分析，揭示了植物在胁迫条件下的代谢物差异、代谢途径以及代谢网络调控应答机制[12]。Yang等[13]对干旱处理的柴胡黄酮类化合物含量进行分析，发现芦丁是其叶片中主要的黄酮类物质，并且在干旱条件下，柴胡叶片中参与黄酮类生物合成的关键基因（C4H、F3H和DFR）的表达量明显下调，导致芦丁含量显著降低。Ma等[14]研究表明，干旱胁迫下的小麦总黄酮和花青素含量明显提高，且CHS、CHI、F3H、黄酮合成酶（FNS）、黄酮醇合成酶（FLS）、DFR和ANS的表达量明显上调。研究表明，干旱胁迫使芝麻种子中的槲皮素含量降低，芦丁、芹黄素、总黄酮、绿原酸和对香豆酸含量增加[15]。
本试验采用非靶向代谢组学技术对干旱胁迫处理的葡萄果实进行了全面检测，通过LC-MS分析了与花色苷相关的差异代谢物。结果表明，共检测到花青素和原花青素两大类物质，共26种。在干旱胁迫条件下，葡萄果实中花青素类物质含量较CK明显降低，而原花青素类物质含量则明显升高，这一现象可能与代谢过程中的酶活性变化密切相关。一方面，干旱胁迫可能导致花青素合成途径中的无色花青素还原酶活性降低，从而抑制了花青素的合成。另一方面，原花青素本身具有较强的抗氧化能力，能够有效清除自由基，帮助植物更好地应对干旱逆境。这种代谢调控机制反映了葡萄在干旱胁迫下的适应性变化，为理解植物在逆境条件下的代谢响应机制提供了新的视角。此外，原花青素的积累可能与木质素合成增强有关。原花青素作为苯丙烷途径的终端产物之一，其前体物质（如香豆酰-CoA）可被竞争性分流至木质素合成，以强化细胞壁抵御水分流失。总的来说，干旱对植物花色苷生物合成的影响较为复杂，且这种影响与不同物种和干旱程度存在较大联系，需根据实际情况具体分析。本研究仅针对‘赤霞珠’葡萄进行了分析，未来可以扩展到其他葡萄品种，以验证结果的普适性；同时可结合转录组学和蛋白质组学，进一步揭示干旱胁迫下花色苷代谢的分子调控机制。