新城疫（ND）和禽流感（AI）是影响家禽的重要疾病，二者发生混合感染会提高家禽的发病率和死亡率。接种ND和AI疫苗可有效减少混合感染的发生。AI病毒具有高变异性，除了及时更换变异毒株外，提高现有疫苗的免疫效果是重要研究方向。因此，开发新的疫苗佐剂是重要的研究方向，其能够减少疫苗抗原用量，并提高疫苗的稳定性[1-2]。
目前，胞嘧啶—鸟嘌呤二核苷酸（CpG）、聚肌胞苷酸（PolyI:C）、脂多糖（LPS）等均作为免疫增强剂进行了研究；此外，人参、皂苷等中药也能增强疫苗的免疫效果[3-4]。在ND和AI疫苗佐剂研究方面，CD40鞭毛蛋白作为佐剂显著增强了AI疫苗的免疫效应[5]；蜂胶黄酮脂质体（PFL）作为免疫增强剂，提高了ND疫苗的血清抗体滴度[6]；淫羊藿多糖蜂胶黄酮佐剂（EPA）、人参茎叶皂苷（GSLS）提高抗AI病毒和ND病毒的血清抗体滴度和免疫反应[4,7]。本研究在前期工作基础上，选择人参、皂苷、CpG及IP1、IP2、IPA等多种免疫增强剂，以SPF鸡为试验对象开展免疫效果比较研究，为明确ND与AI二联疫苗的最佳配套免疫增强剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 二联疫苗制备
试验所用二联疫苗的制备毒株，包括新城疫病毒（NDV，La Sota株，滴度107.0 TCID50/mL）和H9亚型禽流感病毒（AIV，WD株，滴度107.0 TCID50/mL），以及白油佐剂，均由山东华宏生物工程有限公司提供。2种灭活后的病毒和佐剂按1:1:2的比例制备二联疫苗。
1.2 免疫增强剂
免疫增强剂1（IP1）、免疫增强剂2（IP2）和免疫增强剂A（IPA）是商品化的ND疫苗和AI疫苗免疫增强剂。人参（SDHHrenshen202308）和皂苷（SDHHzaogan202401）提取液由山东华宏生物工程有限公司提供。CpG由山东省农业科学院动物科学与兽医研究所提供。
1.3 试验动物与试验设计
本试验在山东华宏生物工程有限公司标准实验动物房中完成。将70只9日龄平均体重约1 kg的SPF鸡（购自山东省农业科学院家禽研究所SPF鸡场）随机分为7组，每组10只，分开饲养。对照组每只鸡皮下注射1 mL二联疫苗和1 mL生理盐水；6个试验组每只鸡皮下注射1 mL二联疫苗和1 mL不同免疫增强剂（IP1、IP2、IPA、人参、皂苷、CpG，每个试验组对应1种免疫增强剂）。
1.4 试验方法
接种疫苗后每周从实验鸡的翅膀静脉中采集血液样本，收集血清，直到23周试验结束。所有血液样本均收集在Eppendorf管中，并在37 ℃下凝结2 h。通过离心分离血清冻存备用。参照文献[8]的方法测定AI和ND的血凝抑制（HI）抗体滴度。使用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 ND-HI抗体滴度
ND-HI抗体滴度的动态变化如图1所示。疫苗免疫后第2周，抗体滴度明显提高，已能够提供免疫保护，说明制备的疫苗具有较好的免疫效果。接种后第9周前，IP1、IP2、IPA、人参和CpG组在所有时间点的抗体滴度均高于对照组，IPA组第4周、IP1组第5周和IP2组第8周时的抗体滴度明显高于其他组。除第21周外，第9周至23周人参组的抗体滴度均低于对照组。综合表明，IP1和IPA可提高ND-HI抗体滴度；在ND抗体持续期内，IPA为二联疫苗提供的免疫增强作用最强，而人参的免疫增强效果不稳定，后期抗体滴度低于对照组。
2.2 AI-HI抗体滴度
3 结论与讨论
接种疫苗后的抗体滴度是评价多种疫苗效果的重要指标。佐剂和免疫增强剂能够非特异性提高疫苗的免疫效果，因此受到越来越多重视，研究不仅针对单一疫苗，且在联合疫苗方面也有广泛的应用前景。ND-AI二联疫苗是目前研究的热点之一。赖欣等[9]研究表明，CpG-ODNs用作疫苗佐剂时，明显改善了抗原呈递细胞的功能，促进疫苗特异性体液和细胞免疫反应的产生，并诱导机体产生较高的血凝抑制抗体滴度。王英利等[10]研究发现，中药组方提取液可有效提高7日龄雏鸡的特异性免疫、非特异性免疫及黏膜免疫功能。本试验结果与以上结果具有相似性。本试验研究结果显示，现有商品化的IP1、IP2和IPA免疫增强作用较好，能刺激鸡体产生较高的抗体滴度，CpG同样具有较好的免疫增强作用，后期通过优化保存和纯化工艺后将会具有更明显的价格优势和更广阔的应用前景。人参和皂苷对疫苗的免疫促进作用不明显，尤其是人参，因此不建议使用人参作为二价ND-AI疫苗的免疫增强剂。