在食品供应链等生态系统中，细菌生物被膜形成引发的抗生素耐药性增强问题已成为日益严峻的人类健康威胁[1]。生物被膜是微生物通过自身分泌的胞外聚合物形成并附着于介质表面的微生物群落[2]。细菌形成生物被膜后，生理活性会发生改变，其抗生素耐药性可提升10～1 000倍，给食品安全与医疗卫生领域带来严重隐患[3-4]。乳酸菌无菌发酵上清液（Cell-free fermentation supernatant，CFS）对细菌生物被膜具有良好的抑制活性。秦苏佳等[5]研究证实，植物乳杆菌CCFM8724的CFS可抑制变异链球菌与白色念珠菌双菌生物被膜形成；Kim等[6]研究发现，从发酵食品中分离的短乳杆菌KCCM 202399的CFS对变异链球菌KCTC5458生物被膜具有抑制作用；Masebe等[7]研究发现，嗜酸乳杆菌La14 150B、植物乳植杆菌B411及鼠李糖乳杆菌ATCC 53103，对聚氯乙烯（PVC）和不锈钢表面的单增李斯特氏菌生物被膜均表现出不同程度的抑制活性。
希瓦氏菌是水产领域常见的优势腐败菌，易在物体表面形成生物被膜，对食品安全与人类健康存在潜在危害[8]。目前，希瓦氏菌生物被膜的调控与抑制已引起广泛关注，但现有研究多聚焦于腐败希瓦氏菌，且生物被膜抑制剂相关报道以植物来源为主[9-11]。海藻希瓦氏菌（Shewanella algae）作为条件致病菌，广泛分布于海产品及海洋环境中，是希瓦氏菌属临床感染常见的病原体之一（占比达35.16%）[12]。该菌可形成生物被膜并存在群体感应现象，然而关于乳酸菌对其生物被膜的抑制作用，目前尚未见相关报道。
本实验室前期已分离筛选获得一株对海藻希瓦氏菌S. algae H434群体感应具有抑制活性的副干酪乳酪杆菌（Lacticaseibacillus paracasei）46。本研究以该乳酸菌为测试菌，在96孔板微量体系及食品加工常用材质（不锈钢、聚丙烯、聚乙烯）表面，探究L. paracasei 46的CFS对S. algae H434生物被膜形成能力的影响及最小生物被膜根除浓度（Minimal biofilm eradication concentration，MBEC）。研究结果可为开发乳酸菌及其发酵产物作为抗生物被膜制剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
副干酪乳酪杆菌L. paracasei 46分离自传统发酵食品，海藻希瓦氏菌S. algae H434分离自贮藏大黄鱼样品，均为本实验室保藏菌株。
培养基配制试剂购自北京索莱宝科技有限公司、国药集团化学试剂有限公司等厂商。改良TSB培养基在原配方基础上调整葡萄糖含量至10 g/L。四环素、链霉素、氯霉素、环丙沙星、甲氧苄啶购自生工生物工程股份有限公司，头孢曲松购自北京索莱宝科技有限公司；抗生素贮存液经0.22 μm滤膜过滤除菌后，于-20 ℃环境保存备用。
SW-CJ-2FD型超净工作台（上海博迅实业公司）；LS-35HD型灭菌锅（江阴滨江医疗设备公司）；SpectraMax i3x型酶标仪（美国美谷分子仪器公司）；5430R型冷冻离心机（德国艾本德公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 菌株活化及L. paracasei 46 CFS制备
L. paracasei 46甘油菌接种于MRS培养基，37 ℃培养24 h后经三区划线纯化，连续活化3代备用；S. algae H434甘油菌接种于TSB液体培养基，28 ℃培养24 h后采用相同纯化方法，活化3代待用。取新鲜活化的L. paracasei 46，以1%（v/v）接种量接入MRS液体培养基，37 ℃培养24 h。菌液离心（9 000 r/min、15 min、4 ℃）收集上清液，经0.22 μm滤膜过滤后，获得CFS样品。
1.2.2 CFS处理对微量体系中生物被膜抗生素敏感性的影响
抗生素MBEC测定参考曹海鹏等[13]研究方法并略作调整。制备含1%和3%（v/v）L. paracasei 46 CFS的改良TSB培养基，将新鲜活化的S. algae H434菌液调至0.5 McFarland单位，以1%（v/v）接种量接入上述培养基，混匀后加入96孔板每孔200 μL；对照组（CK）不添加乳酸菌CFS。28 ℃培养24 h后，移除浮游菌，用pH 7.0的PBS缓冲液洗涤96孔板2次并晾干，随后加入含二倍梯度浓度（0.625～640 μg/mL）抗生素的改良TSB培养基。继续培养24 h后，以肉眼观察到培养液清澈透明时对应的最低抗生素质量浓度作为MBEC，每组设3个平行样。
1.2.3 CFS处理对不同材质表面生物被膜形成的影响
介质表面生物被膜形成量测定参照Wang等[14-15]研究方法并略作调整。制备含3%（v/v）L. paracasei 46 CFS的改良TSB培养基，对照组（CK）不添加乳酸菌CFS。向50 mL离心管中加入10 mL上述培养基，放入无菌试片后，以1%（v/v）接种S. algae H434，28 ℃培养24 h。培养结束后，取出试片，用10 mL pH 7.0的PBS缓冲液冲洗表面浮游菌，洗液收集至原离心管，即为浮游菌液；将试片转入含10 mL PBS的离心管，冰浴条件下40 kHz超声处理20 min，使生物被膜内菌体重悬，获得生物被膜菌体悬液。将上述菌悬液进行10倍梯度稀释，涂布于TSB平板，28 ℃培养48 h后进行菌落计数，每组设3个平行样。测试试片材质为聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚乙烯（Polyethylene，PE）及304不锈钢。
1.2.4 CFS处理对不同材质表面生物被膜抗生素敏感性的影响
参照1.2.3方法，实验组采用3% L. paracasei 46 CFS进行预处理，对照组不进行CFS预处理。接种S. algae H434后，28 ℃培养24 h，取出试片并洗去表面浮游菌，随后将试片放入含二倍梯度浓度（0.625～640 μg/mL）抗生素的改良TSB液体培养基中。28 ℃继续培养24 h后，将洗去浮游菌的试片转入含PBS的离心管，40 kHz冰浴超声处理20 min，使生物被膜菌体重悬；96孔板中每孔加入200 μL菌悬液，以肉眼观察到培养液清澈透明时对应的最低抗生素质量浓度作为MBEC，每组设3个平行样。
1.3 数据处理
所有实验均进行3次独立重复。数据分析采用SPSS 27.0软件，通过单因素方差分析（ANOVA）检验数据统计学意义；图表采用Origin 2021软件绘制。
2 结果与分析
2.1 CFS处理对微量体系中生物被膜抗生素敏感性的影响
96孔板微量体系中，L. paracasei 46 CFS预处理对S. algae H434生物被膜抗生素敏感性的影响如表1所示。从抗生素种类来看，氯霉素MBEC从2.5 μg/mL降至1.25 μg/mL，链霉素MBEC从320 μg/mL降至40 μg/mL，头孢曲松MBEC降幅最明显，由320 μg/mL降至20 μg/mL。这表明L. paracasei 46 CFS预处理可提高S. algae H434生物被膜对氯霉素、链霉素及头孢曲松的敏感性，降低其抗生素MBEC。在本实验设定的CFS添加量范围内，预处理对四环素、环丙沙星及甲氧苄啶的生物被膜根除效果无明显MBEC变化，提示L. paracasei 46 CFS对不同抗生素的MBEC影响存在特异性差异。
表1 L. paracasei 46 CFS 处理对96孔板中S. algae H434生物被膜抗生素MBEC 的影响 (μg/mL) |
| 抗生素 | MBEC | ||
|---|---|---|---|
| 对照组 | 1% CFS处理组 | 3% CFS处理组 | |
| 四环素 | 80 | 80 | 80 |
| 氯霉素 | 2.5 | 1.25 | 1.25 |
| 链霉素 | 320 | 160 | 40 |
| 环丙沙星 | 40 | 40 | 40 |
| 甲氧苄啶 | 320 | 320 | 320 |
| 头孢曲松 | 320 | 320 | 20 |
从CFS预处理浓度来看，链霉素MBEC在1% CFS处理组为160 μg/mL，3% CFS处理组降至40 μg/mL；头孢曲松MBEC从1% CFS处理组的320 μg/mL降至3% CFS处理组的20 μg/mL。而氯霉素未呈现类似浓度效应，1%与3% CFS处理组MBEC无明显差异，推测可能需要更高浓度CFS才能产生差异。头孢曲松方面，1% CFS处理组与对照组MBEC无明显差异，3% CFS处理组则表现出明显降低效应。上述结果提示，抗生素MBEC与L. paracasei 46 CFS预处理浓度存在关联。
2.2 CFS处理对不同材质表面生物被膜形成的影响
食品加工常用材质表面易形成生物被膜，这不仅加剧食品安全隐患，还增加了风险管控成本，因此需采取措施预防以减少生物被膜形成。乳酸菌CFS可减少不同材质表面生物被膜的形成[16]。304不锈钢、PP、PE是食品加工与贮运过程中的常用材质，本试验探究了L. paracasei 46 CFS对S. algae H434在上述3种材质表面生物被膜形成及浮游菌生长的抑制作用。
2.3 CFS处理对不同材质表面生物被膜抗生素敏感性的影响
微生物形成生物被膜后，对抗生素等消杀试剂的耐受性明显增强，增大了消杀除菌的挑战。本实验以MBEC为评价指标（MBEC越低，抗生素敏感性越高），探究L. paracasei 46 CFS对S. algae H434在不锈钢和PP材质表面生物被膜抗生素敏感性的影响。
由表2可知，3% L. paracasei 46 CFS处理后，不锈钢试片表面生物被膜的氯霉素MBEC为2.5 μg/mL，头孢曲松MBEC为2.5 μg/mL，而对照组对应的MBEC分别为5和40 μg/mL。说明CFS处理可提高不锈钢试片表面S. algae H434生物被膜的抗生素敏感性，且敏感性提升程度依赖于抗生素种类。
表2 L. paracasei 46 CFS处理对不锈钢、PP试片表面生物被膜抗生素MBEC的影响单位：（μg/mL） |
| 抗生素 | MBEC | |||
|---|---|---|---|---|
| 不锈钢试片对照组 | 3%CFS处理不锈钢试片组 | PP试片对照组 | 3% CFS处理PP试片组 | |
| 氯霉素 | 5 | 2.5 | 10 | 2.5 |
| 头孢曲松 | 40 | 2.5 | 40 | 2.5 |
PP试片表面呈现类似规律，对照组氯霉素与头孢曲松的MBEC分别为10和40 μg/mL，经CFS处理后，2种抗生素的MBEC均降至2.5 μg/mL，提示PP试片表面生物被膜的抗生素敏感性同样得到提升。
3 结论与讨论
自然界中多数细菌可通过形成生物被膜适应环境与自我保护，增强对不良环境的耐受性[17]。当有害微生物在食品加工接触材料、医疗器械表面及人体生物界面形成生物被膜时，易引发食品安全风险与医疗卫生问题。食品加工环境为微生物生长繁殖提供了适宜条件，原料、设备及操作人员均可能成为污染来源[2]。希瓦氏菌作为水产源常见腐败菌，部分种属（比如海藻希瓦氏菌）为人畜共患及水生病原体，海藻希瓦氏菌是希瓦氏菌属临床感染的主要致病菌[12]；生物被膜的形成会增强其对抗生素的抵抗力，进一步加剧细菌耐药性问题。乳酸菌作为公认安全的益生菌，其无菌发酵上清液（CFS）用于抑制细菌生物被膜时，不会诱导耐药性产生，具备良好的应用潜力[18]。
研究发现，在测试浓度范围内，L. paracasei 46 CFS预处理可提高S. algae H434生物被膜对氯霉素、链霉素及头孢曲松的敏感性，但对四环素、环丙沙星及甲氧苄啶的MBEC无显著影响，该差异可能与抗生素作用机制、生物被膜渗透性及菌株耐药机制相关[19，21，28]。所测试抗生素分属不同类别，氯霉素（酰胺醇类）、链霉素（氨基糖苷类）、头孢曲松（β-内酰胺类）、四环素（四环素类）、环丙沙星（喹诺酮类）及甲氧苄啶（叶酸还原酶抑制剂类），其作用靶点各异，涉及蛋白质合成、细胞壁合成及核酸代谢等[29]。此外，抗生素的分子量、脂溶性及电荷等特性会影响其对生物被膜的渗透能力，环丙沙星分子量较小且具有两亲性，自身对生物被膜的渗透率较高[30]，推测L. paracasei 46 CFS预处理可能与环丙沙星的作用方式互补性有限，或者3% CFS浓度偏低还不足以产生有效的协同作用，故未观察到MBEC变化；而氨基糖苷类（带正电荷）与β-内酰胺类（分子量大）抗生素通常难以穿透生物被膜或渗透缓慢[31]，3% CFS预处理可能通过改善其生物被膜渗透性，从而提高了S. algae H434对链霉素和头孢曲松的敏感性。
本研究证实了L. paracasei 46 CFS预处理既能抑制S. algae H434生物被膜形成，又能降低抗生素MBEC，具有良好的应用前景。为推动其产业化开发，后续研究将进一步探究该CFS与更多类别抗生素的联用效果，以及对其他有害菌生物被膜的作用；同时，开展CFS中活性物质的分离纯化工作，明确其理化性质与抗生物被膜作用机制。