镰刀菌（Fusarium spp.）是一种广泛寄生于土壤及动植物有机体表面与组织中的真菌，可侵染多种粮食作物与经济作物，引发根腐、茎腐、穗（粒）腐等多种病害，最终造成寄主作物萎蔫枯死[1-2]。镰刀菌侵染可能会干扰寄主作物的正常生长发育进程，导致作物减产[3-4]。
镰刀菌的检测手段主要有分子检测（如普通PCR、实时荧光定量PCR）、免疫学方法（如ELISA检测毒素）等。唐彤彤等[5]研究表明，使用环介导等温扩增技术可检测番茄枯萎病中的尖孢镰刀菌；梁伊菲等[6]研究表明，黄芪根腐病尖孢镰刀菌的LAMP快速检测方法对尖孢镰刀菌具有良好的特异性；朱倩丽等[7]使用巢式PCR技术检测玉米茎基腐病主要致病菌禾谷镰刀菌。现有研究多针对特定靶标镰刀菌开展检测技术研究，但部分植物及农作物常受多种镰刀菌复合侵染，当前针对多种镰刀菌的同步诊断与综合防控技术研究有待进一步深入。本文主要结合镰刀菌的特异性保守序列区域设计了通用型特异性引物，使用等温扩增荧光法进行了特异性检测，同时以普通PCR方法为对照，进行了灵敏度检测，为镰刀菌的早期诊断提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株：层出镰刀菌（1-CC）、腐皮镰刀菌（15-FP）、禾谷镰刀菌（36-HG）、假禾谷镰刀菌（XS24-1）、禾谷镰刀菌小种（南方镰孢）（NF-HG）、尖孢镰刀菌（Z5）、尖孢镰刀菌（J2）、尖孢镰刀菌（45-3）、稻绿核菌（DLHJ）和麦角蜜孢霉（MJMBM），10个样本均取自云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程研究中心。
1.2 试剂与仪器
试剂：样本释放剂（真菌—核酸）（瑞栢泰生物），核酸通用反应液（Optigene Limited），特异性引物（金唯智生物）。仪器：台式高速冷冻离心机（KDC-140HR，中科中佳）、超微量分光光度计（NanoBio200，奥谱天成）、旋涡混匀器（BK-VX1，山东博科）、离心机（BHR-16MR，山东博科）、生物安全柜（BSC-1500IIA2-X，山东博科）、等温扩增荧光检测系统Genie Ⅱ（Optigene Limited）。
1.3 试验方法
1.3.1 常规PCR法
取适量镰刀菌菌丝加入100 μL样本释放剂进行核酸提取，96 ℃金属浴加热3 min，离心取上清液，用超微量分光光度计检测DNA样品的浓度和纯度。
1.3.2 等温扩增荧光法
采用25 μL反应体系（反应液15 μL、引物6 μL、样本4 μL），扩增程序设置为65 ℃反应30 min，熔解程序为80～98 ℃，0.05 ℃为1个循环。针对镰刀菌保守区设计18S-1、28S-1共2套引物，包括1对外引物（F3，B3）、1对内引物（FIP，BIP）和1对环引物（LoopF，LoopB），引物序列见表1。
表1 引物序列 |
| 引物 | 引物名称 | 引物序列（5’—3’） |
|---|---|---|
| 18S-1 | F3上游外部引物 | TTGCTGGTTATCCACTTCTTAG |
| B3下游外部引物 | TAATCAACGCAAGCTGATGA | |
| FIP上游内部引物 | TAGACTCGCTGGCTCCGTAATAACAGGTCTGTGATGC | |
| BIP下游内部引物 | GGCCGAGAGGTCTTGGTAATCATTCCTCGTTGAAGAG | |
| LoopF上游环状引物 | CGGCCCAGAACGTCTAAG | |
| LoopB下游环状引物 | TGAAACTCCGTCGTGCTG | |
| 28S-1 | F3上游外部引物 | GGAGTGTTATAGCCCGTTG |
| B3下游外部引物 | CTACACAGGCATAGTTCACC | |
| FIP上游内部引物 | GAACACTCGCATACGAAGACGACTGGCGTAATGGTC | |
| BIP下游内部引物 | AAGTGAACGCAGGTGAGAGCCTTACTCAAATCCATC | |
| LoopF上游环状引物 | CTCCTTGGTCCGTGTTTCA | |
| LoopB下游环状引物 | CATCATCGACCGATCCTGAT |
1.4 测定指标及方法
1.4.1 引物筛选与扩增
使用等温扩增荧光法，利用筛选到的通用引物对1-CC、15-FP、36-HG、XS24-1和NF-HG等镰刀菌菌株的核酸样本进行上机扩增检测，筛选合适引物进行特异性扩增试验。
1.4.2 灵敏度检测
选用样本释放剂提取的15-FP核酸，使用ddH2O按10倍比例稀释至10-7为模板；使用常规PCR法、等温扩增荧光法开展检测，同步设置阴性对照，确定检测限。
2 结果与分析
2.1 引物筛选与特异性扩增
表2 18S-1/28S-1引物扩增结果 |
| 样本编号 | 扩增时间/s | 熔解温度/℃ | ||
|---|---|---|---|---|
| 18S-1 | 28S-1 | 18S-1 | 28S-1 | |
| NC | - | - | - | - |
| 1-CC | 451 | - | 89.64 | - |
| 15-FP | 501 | 1 085 | 89.83 | 89.46 |
| 36-HG | 492 | 1 180 | 89.57 | 88.87 |
| XS24-1 | 488 | 1 234 | 89.23 | 89.49 |
| NF-HG | 489 | - | 89.89 | - |
| J2 | 488 | - | 89.97 | - |
| Z5 | 465 | - | 89.41 | - |
| 45-3 | 478 | 1 302 | 88.30 | 81.7 |
|
2.2 灵敏度检测
2.2.1 普通PCR法
由图2可知，本组试验对15-FP（10-7～10-1浓度）进行检测，其中10-1、10-2、10-3浓度均出现电泳条带，检测限为10-3。
2.2.2 等温扩增荧光法
由表3可知，对15-FP（10-7～10-1浓度）进行检测，样本浓度>10-5时，扩增时间在460～694 s，熔解温度在87.79～87.93 ℃，荧光值在79～92 K。以上结果表明，所建立的方法检测限为10-5。
表3 灵敏度检测实验结果 |
| 孔号 | 样本 | 扩增时间/s | 熔解温度/℃ | 荧光值/K |
|---|---|---|---|---|
| 1 | NC | - | - | - |
| 2 | F-1 | 460 | 87.89 | 84 |
| 3 | F-2 | 492 | 87.85 | 86 |
| 4 | F-3 | 540 | 87.93 | 92 |
| 5 | F-4 | 576 | 87.79 | 83 |
| 6 | F-5 | 694 | 87.86 | 79 |
| 7 | F-6 | - | - | - |
| 8 | F-7 | - | - | - |
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3 结论
本文主要结合镰刀菌的特异性保守序列区域设计了通用型特异性引物并进行筛选，使用等温扩增荧光法进行特异性检测，同时以普通PCR方法为对照进行灵敏度检测。结果表明，18S-1引物组扩增效率高、时间短，宜作为最佳引物组应用到后续试验中；等温扩增荧光法可进行镰刀菌的特异性检测，检测限为10-5浓度，普通PCR检测限为10-3浓度。本研究成功构建了一套针对镰刀菌的高灵敏度通用核酸检测体系，等温扩增荧光法的灵敏度是普通PCR方法的100倍。该方法加快了镰刀菌的现场快速检测进程，通过灵敏度与特异性验证测试，证实了该检测体系的可靠性和精确性。本文为镰刀菌的快速鉴定提供了技术路径。