小麦粉中4种黄曲霉毒素的高效液相色谱检测方法学建立与评价

杜蒙; 李雯雯; 梁卫红; 王晓军; 季飞; 黄义春; 贾瑞杰; 王璐莹; 孙允超

doi:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2026.07.024

安徽农学通报 >

2026 , Vol. 32 >Issue 7: 96 - 100

DOI: https://doi.org/10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2026.07.024

农产品加工·检验检测

小麦粉中4种黄曲霉毒素的高效液相色谱检测方法学建立与评价

杜蒙 ¹ ,
李雯雯 ¹ ,
梁卫红 ² ,
王晓军 ¹ ,
季飞 ³ ,
黄义春 ⁴ ,
贾瑞杰 ¹ ,
王璐莹 ¹ ,
孙允超 ¹

展开

^1. 聊城市农业科学院，山东聊城 252000
^2. 聊城市东昌府区柳园街道办事处，山东聊城 252000
^3. 聊城市茌平区农业发展服务中心，山东聊城 252000
^4. 临清市农业农村局，山东临清 252600

孙允超（1985—），男，山东聊城人，硕士，正高级农艺师，从事作物育种栽培与农产品质量安全研究。

杜蒙（1990—），女，山东聊城人，硕士，农艺师，从事农产品质量安全工作。

Copy editor: 张琴

收稿日期: 2025-06-20

网络出版日期: 2026-04-14

基金资助

山东省小麦产业技术体系聊城试验站专项(SDAIT-01-19)

国家小麦产业技术体系聊城试验站专项(CARS-3-2)

小麦新品种聊麦191高产遗传基础解析与关键栽培技术集成推广(2024YD88)

聊城市重点研发计划（政策引导类）项目(2024YD88)

收起

Establishment and evaluation of a high performance liquid chromatography method for the determination of four aflatoxins in wheat flour

Du Meng ¹ ,
Li Wenwen ¹ ,
Liang Weihong ² ,
Wang Xiaojun ¹ ,
Ji Fei ³ ,
Huang Yichun ⁴ ,
Jia Ruijie ¹ ,
Wang Luying ¹ ,
Sun Yunchao ¹

Expand

^1. Liaocheng Academy of Agricultural Sciences, Liaocheng 252000, China
^2. Liuyuan Sub-district Office, Dongchangfu District, Liaocheng 252000, China
^3. Agricultural Development Service Center of Chiping District, Liaocheng 252000, China
^4. Linqing City Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Linqing 252600, China

Received date: 2025-06-20

Online published: 2026-04-14

Fold

摘要

为建立小麦粉中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂（AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂）的高效检测方法，本研究基于高效液相色谱—荧光检测技术（HPLC-FLD），对样品前处理及色谱条件进行了系统优化。结果表明，乙腈—水（80∶20，v/v）结合氯化钠盐析效应作为提取溶剂，可明显提高目标物回收率；经免疫亲和柱净化与三氟乙酸衍生化后，样品基质干扰得以有效去除。色谱条件优化后，4种黄曲霉毒素在0.1～20.0 ng/mL浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（r²）均大于0.999 9。方法学验证结果显示，该方法的检出限（LOD）介于0.008～0.017 ng/g，定量限（LOQ）在0.026～0.055 ng/g；在0.5～5.0 ng/mL浓度水平下，平均回收率为80.2%～89.5%，相对标准偏差（RSD）均小于2.0%，；6次平行测定稳定性试验RSD小于1.5%，质控样品检测RSD小于0.12%，方法稳定性良好。综上，该方法前处理简便、灵敏度高、准确度好，适用于小麦粉中多种黄曲霉毒素的痕量检测。

关键词： 黄曲霉毒素; 柱前衍生; 免疫亲和柱净化; 高效液相色谱; 小麦粉

本文引用格式

杜蒙 , 李雯雯 , 梁卫红 , 王晓军 , 季飞 , 黄义春 , 贾瑞杰 , 王璐莹 , 孙允超 . 小麦粉中4种黄曲霉毒素的高效液相色谱检测方法学建立与评价[J]. 安徽农学通报, 2026 , 32(7) : 96 -100 . DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2026.07.024

Abstract

To establish an efficient method for the determination of aflatoxins B₁, B₂, G₁, and G₂ (AFB₁, AFB₂, AFG₁, AFG₂) in wheat flour, this study systematically optimized sample pretreatment and chromatographic conditions based on high-performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD). The results showed that acetonitrile–water (80∶20, v/v) combined with sodium chloride salting-out as the extraction solvent significantly improved the recovery of target analytes. After purification with immunoaffinity columns and derivatization with trifluoroacetic acid, matrix interferences were effectively removed. Under the optimized chromatographic conditions, the four aflatoxins exhibited good linearity in the concentration range of 0.1–20.0 ng/mL, with correlation coefficients (r²) all greater than 0.999 9. Method validation results indicated that the limits of detection (LOD) ranged from 0.008 to 0.017 ng/g, and the limits of quantification (LOQ) were 0.026–0.055 ng/g. At spiked levels of 0.5–5.0 ng/mL, the average recoveries were 80.2%–89.5%, with relative standard deviations (RSDs) all less than 2.0%. The RSD of the six-replicate stability test was below 1.5%, and the RSD for quality control sample analysis was less than 0.12%, demonstrating good method stability. In conclusion, the developed method featured simple pretreatment, high sensitivity, and satisfactory accuracy, and was suitable for the trace determination of multiple aflatoxins in wheat flour.

Key words： aflatoxins; pre-column derivatization; immunoaffinity column cleanup; high performance liquid chromatography; wheat flour

黄曲霉毒素（AFT）被世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，具有毒性强、污染范围广等特点，我国明确规定粮食中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）限量值为5 µg/kg^[1]。目前，黄曲霉毒素常用检测技术包括酶联免疫法（ELISA）、薄层色谱法、电化学法、荧光法等。ELISA操作简便，但易受基质干扰，且难以实现多组分同步测定。章先等^[2]制备的纳米金ELISA试剂盒检测限可达0.05 µg/kg，但对黄曲霉毒素G₁（AFG₁）、黄曲霉毒素G₂（AFG₂）存在交叉反应，多组分检测特异性不足。高效液相色谱法（HPLC）因其高灵敏度、高选择性和良好的重复性，成为黄曲霉毒素检测的常用方法。王艳红等^[3]采用乙腈—水（84∶16，v/v）提取小麦中黄曲霉毒素B₁，结合免疫亲和柱净化与光化学柱后衍生技术，检测效果优于常规方法。常规HPLC柱后衍生试剂腐蚀性较强，易影响方法稳定性。本研究将柱前衍生与免疫亲和柱净化联用，系统优化提取溶剂、衍生条件及色谱参数，建立同步测定小麦粉中4种黄曲霉毒素的高效分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（e2695），Waters公司；数显高速分散均质机，上海沪析实业有限公司；电子天平（YP20002，0.01 g），上海佑科仪器仪表有限公司；高速冷冻离心机（BY‑R20），北京白洋医疗器械有限公司；氮吹浓缩仪（MFV‑24），广州得泰仪器科技有限公司；电热鼓风干燥箱（101‑3AB），天津泰斯特仪器有限公司；磨粉机（JYS‑M01），九阳股份有限公司。

1.2 试剂与耗材

黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂混合标准品（1.00 μg/mL，乙腈基体）、小麦黄曲霉毒素质控样品，坛墨质检科技股份有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯），赛默飞世尔科技有限公司；正己烷（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠，上海麦克林生化科技股份有限公司；免疫亲和净化柱，ROMER公司；玻璃纤维滤纸，Whatman公司；0.22 μm针式微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 试验样品

小麦样品取自聊城市农业科学院试验基地。

1.4 试验方法

1.4.1 标准溶液的制备

（1）标准储备溶液（100 ng/mL）。移取500 μL黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂混合标准品（1.00 μg/mL），用乙腈稀释并定容至5 mL容量瓶中，配制100 ng/mL的混合标准储备溶液。

（2）标准系列工作溶液。分别准确移取100 ng/mL标准储备溶液10、50、200、500、1 000、2 000 μL至10 mL容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，配制成质量浓度为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL的系列标准工作溶液。

1.4.2 空白样品制备

取小麦样品1 kg，经磨粉机粉碎后过2 mm筛，密封保存备用。

1.4.3 提取溶剂的优化

依据GB 5009.22—2016 《食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》^[4]，以乙腈—水、甲醇—水为提取溶剂，设置甲醇∶水（50∶50、70∶30、80∶20、90∶10）、乙腈∶水（50∶50、70∶30、80∶20、90∶10）共8组不同体积比的提取体系，分别对空白小麦基质加标样品进行提取处理，经净化、衍生及高效液相色谱测定后，计算各体系下4种黄曲霉毒素的提取回收率，以平均回收率为评价指标，确定最优提取溶剂。样品提取时加入1 g NaCl，利用盐析效应减少基质干扰，提升目标物提取效果^[5]。

1.4.4 样品提取

称取小麦试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈—水溶液（80∶20，v/v），涡旋混匀后，用均质机均质3 min，经玻璃纤维滤纸过滤，取上清液备用。

1.4.5 样品净化及衍生

待免疫亲和柱内液体流尽后，将样液移入柱中；样液流完后，用2份10 mL水淋洗免疫亲和柱，抽干后更换10 mL试管承接。加入3份1 mL甲醇进行洗脱，抽干后收集洗脱液。取4.0 mL净化后的洗脱液于10 mL试管中，40 ℃氮吹至近干，加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸，涡旋混匀30 s，40 ℃衍生15 min；衍生完成后，再次40 ℃氮吹至近干，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋溶解后经0.22 μm滤膜过滤，供进样分析。

1.4.6 液相色谱条件

色谱柱，Alphasil VC-C18 柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；检测器为荧光检测器；激发波长360 nm，发射波长440 nm；柱温40 ℃；流动相A为水，B为乙腈—甲醇（50∶50，v/v），采用70∶30比例等梯度洗脱0～35 min；流速1.0 mL/min；进样量20 μL。

1.4.7 标准曲线

将配制好的0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL系列标准工作溶液，在优化后的液相色谱条件下依次进样分析，记录各黄曲霉毒素组分的峰面积。以目标毒素质量浓度（X，ng/mL）为横坐标，对应峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，计算回归方程与相关系数（r²），考察线性关系与线性范围。

1.4.8 精密度

采用多水平重复试验进行方法精密度验证。选取同一批次小麦样品，经优化步骤处理后，在相同高效液相色谱条件下测定。设置0.5、2.0、5.0 ng/mL 3个浓度水平，每一水平平行测定3次，计算平均值、标准偏差（SD）及相对标准偏差（RSD），以此评价方法精密度。

1.4.9 检出限和定量限

以0.5 ng/mL浓度水平重复测定6次，计算平均值与SD，以3倍SD确定方法检出限（LOD），10倍SD确定方法定量限（LOQ）。

1.4.10 稳定性

采用多次平行试验验证方法稳定性。选取2.0 ng/mL标准溶液，按优化后的方法独立测定6次，计算测定结果的平均值、标准偏差及相对标准偏差，以此评价方法稳定性。

1.4.11 质控样品检测

采用小麦黄曲霉毒素标准物质作为质控样品，选取4种质控样品经优化步骤处理后，按既定HPLC条件测定，每个样品平行测定3次，通过计算平均值、RSD及回收率，验证检测方法的准确性与可靠性。

1.5 数据处理

采用HPLC配套的Empower工作站软件，绘制AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂ 4种黄曲霉毒素的标准工作曲线，计算回归方程与相关系数。数据统计分析利用Excel软件完成。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂优化

由表1可知，乙腈—水溶液（80∶20，v/v）对黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的平均提取回收率最优，为85.55%，因此选定该体系作为小麦粉中4种黄曲霉毒素的提取溶剂。

表1 不同提取液下4种黄曲霉毒素的提取回收率单位：%

提取液	体积比	AFB₁回收率	AFB₂回收率	AFG₁回收率	AFG₂回收率	平均回收率
甲醇∶水	50∶50	74.1	76.8	75.5	81.0	76.85
甲醇∶水	70∶30	78.6	80.4	78.9	84.1	80.50
甲醇∶水	80∶20	79.8	85.6	80.2	88.3	83.48
甲醇∶水	90∶10	78.9	83.6	80.8	86.8	82.53
乙腈∶水	50∶50	75.4	78.9	76.1	82.2	78.15
乙腈∶水	70∶30	79.9	84.2	80.0	85.8	82.48
乙腈∶水	80∶20	81.3	89.2	82.2	89.5	85.55
乙腈∶水	90∶10	80.3	85.3	81.5	87.9	83.75

2.2 标准曲线

由表2可知，4种黄曲霉毒素在0.1～20.0 ng/mL浓度范围内，标准曲线相关系数（r²）>0.999 9，满足色谱定量分析要求。各毒素校准曲线截距均为0，表明试验体系背景信号控制良好，试剂纯度、仪器基线稳定性及操作环境均符合痕量分析要求。

表2 相关系数和线性范围

序号	毒素类型	回归方程	相关系数	线性范围/ （ng/mL）
1	AFG₁	Y = 6.42×10⁵ X	0.999 9	0.1～20.0
2	AFB₁	Y = 1.56×10⁶ X	0.999 9
3	AFG₂	Y = 1.01×10⁶ X	0.999 9
4	AFB₂	Y = 2.31×10⁶ X	0.999 9

由图1可知，AFG₁（8.62 min）、AFB₁（12.04 min）、AFG₂（18.90 min）、AFB₂（28.19 min）分离效果良好，保留时间互不干扰，表明所选色谱柱与流动相体系适配性优良，可实现不同极性毒素组分的有效分离。各组分峰面积随浓度升高呈良好线性递增，检测系统动态范围较宽，可满足复杂基质中痕量毒素的准确定量需求。

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图1 黄曲霉毒素色谱

2.3 精密度

由表3可知，4种黄曲霉毒素在0.5～5.0 ng/mL浓度范围内回收率在80.2%～89.5%。其中，AFG₂、AFB₂回收率在0.5 ng/mL 浓度水平下，分别为86.9%、87.2%；在5.0 ng/mL浓度水平下分别为85.4%、84.2%，回收率良好。3次平行测定结果离散度小，SD均<0.03 ng/mL，RSD均<2.0%。综合表明，该方法在较宽浓度范围内具有良好的准确度与重现性，可满足复杂基质中黄曲霉毒素痕量分析的要求。

表3 4种黄曲霉毒素检测方法的精密度试验结果

序号	毒素类型	溶液浓度/ （ng/mL）	浓度/（ng/mL）			平均值/ （ng/mL）	SD/（ng/mL）	回收率/%	RSD/%
序号	毒素类型	溶液浓度/ （ng/mL）	trial 1	trial 2	trial 3	平均值/ （ng/mL）	SD/（ng/mL）	回收率/%	RSD/%
1	AFG₁	0.5	0.411	0.415	0.413	0.41	0.002	82.6	0.48
		2.0	1.651	1.640	1.639	1.64	0.007	82.2	0.41
		5.0	4.033	4.058	4.082	4.06	0.025	81.2	0.60

2	AFB₁	0.5	0.410	0.395	0.398	0.40	0.008	80.2	1.98
		2.0	1.618	1.653	1.605	1.63	0.025	81.3	1.53
		5.0	4.110	4.056	4.073	4.08	0.028	81.6	0.68

3	AFG₂	0.5	0.442	0.430	0.431	0.43	0.007	86.9	1.53
		2.0	1.785	1.799	1.787	1.79	0.008	89.5	0.42
		5.0	4.271	4.266	4.267	4.27	0.003	85.4	0.06

4	AFB₂	0.5	0.439	0.432	0.437	0.44	0.004	87.2	0.83
		2.0	1.788	1.786	1.778	1.78	0.005	89.2	0.30
		5.0	4.210	4.212	4.203	4.21	0.005	84.2	0.11

2.4 检出限和定量限

由表4可知，4种黄曲霉毒素的重复性SD均低于0.005 5 ng/mL，其中AFB₂的SD低至0.002 6 ng/mL，6次测定结果在0.432～0.439 ng/mL内波动，数据离散程度小。

表4 4种黄曲霉毒素检测方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）验证结果

序号	毒素类型	标准溶液浓度/ （ng/mL）	样品溶液检测浓度（ng/mL）						平均值/ （ng/mL）	SD/ （ng/mL）	检出限/ （ng/g）	定量限/ （ng/g）
序号	毒素类型	标准溶液浓度/ （ng/mL）	trial 1	trial 2	trial 3	trial 4	trial 5	trial 6	平均值/ （ng/mL）	SD/ （ng/mL）	检出限/ （ng/g）	定量限/ （ng/g）
1	AFG₁	0.5	0.397	0.399	0.391	0.388	0.388	0.400	0.394	0.005 5	0.017	0.055
2	AFB₁	0.5	0.402	0.394	0.395	0.398	0.392	0.397	0.396	0.003 5	0.011	0.035
3	AFG₂	0.5	0.434	0.442	0.430	0.431	0.432	0.432	0.434	0.004 4	0.013	0.044
4	AFB₂	0.5	0.437	0.439	0.432	0.437	0.437	0.439	0.437	0.002 6	0.008	0.026

在方法灵敏度方面，4种毒素的方法检出限（LOD）在0.008～0.017 ng/g，定量限（LOQ）在0.026～0.055 ng/g，其中AFB₂的LOQ低至0.026 ng/g，均显著低于现行食品安全限量要求，表明该方法适用于食品基质中痕量污染物的检测。综合表明，该方法在准确度、重复性及灵敏度方面均满足痕量毒素检测要求。

2.5 方法稳定性

以2.0 ng/mL标准溶液进行6次平行测定，考察方法稳定性。由表5可知，4种黄曲霉毒素平均测定值在1.617～1.789 ng/mL，RSD均<1.5%，平行测定结果最大差值<0.038 ng/mL。结果表明，该方法对痕量毒素检测具有良好的重复性与稳定性。

表5 4种黄曲霉毒素检测方法的稳定性试验结果

序号	毒素类型	标准溶液浓度/ （ng/mL）	trial 1	trial 2	trial 3	trial 4	trial 5	trial 6	平均值/（ng/mL）	SD/（ng/mL）	RSD/%
1	AFG₁	2.0	1.648	1.651	1.640	1.639	1.615	1.613	1.634	0.016	1.00
2	AFB₁	2.0	1.630	1.618	1.653	1.605	1.597	1.598	1.617	0.022	1.35
3	AFG₂	2.0	1.808	1.785	1.799	1.787	1.779	1.775	1.789	0.012	0.70
4	AFB₂	2.0	1.799	1.788	1.786	1.778	1.774	1.769	1.782	0.011	0.61

2.6 质控样品检测

选取4种质控样品，经优化后的提取、净化及衍生化步骤处理，每份样品平行测定3次。由表6可知，4种黄曲霉毒素（AFG₁、AFB₁、AFG₂、AFB₂）的RSD均小于0.12%，回收率在80.8%～88.1%，表明该方法具有良好的重复性与稳定性。

表6 质控样品黄曲霉毒素检测结果

毒素类型	质控样品编号	标准值/（μg/kg）	样品溶液浓度/（ng/mL）			平均值/ （μg/kg）	RSD/%	回收率/%
毒素类型	质控样品编号	标准值/（μg/kg）	trial 1	trial 2	trial 3	平均值/ （μg/kg）	RSD/%	回收率/%
AFG₁	TMQC0497	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0498	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0710	10.40	8.413	8.398	8.402	8.404	0.09	80.8
AFB₁	TMQC0497	5.60	4.593	4.589	4.595	4.592	0.07	82.0
	TMQC0498	10.50	8.633	8.626	8.629	8.629	0.04	82.2
	TMQC0710	8.80	7.218	7.220	7.217	7.218	0.02	82.0
AFG₂	TMQC0497	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0498	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0710	10.40	9.156	9.152	9.160	9.156	0.04	88.1
AFB₂	TMQC0497	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0498	—	—	—	—	—	—	—
	TMQC0710	5.1	4.439	4.430	4.440	4.436	0.12	86.9

注：“—”代表未检出。

3 结论与讨论

本研究建立了一种基于高效液相色谱—荧光检测器（HPLC-FLD）的小麦粉中多种黄曲霉毒素同步检测方法。采用乙腈—水（80∶20，v/v）为提取溶剂，并结合NaCl盐析效应，有效提高目标物回收率。赵英莲等^[6]研究表明，前处理结合免疫亲和柱净化，可显著降低基质效应，对色素及脂类干扰物的去除率达98%以上，净化效果优于常规QuEChERS方法。本研究建立的方法检出限（LOD）在0.008～0.017 ng/g，定量限（LOQ）低至0.026 ng/g，显著低于GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》规定的限量要求；与HPLC-MS/MS法（LOQ：0.05～0.10 μg/kg）相比，灵敏度提高2～4倍^[7]，且无需使用高成本质谱检测器。在0.1～20.0 ng/mL范围内，4种黄曲霉毒素标准曲线线性关系良好（r²>0.999 9），定量准确性优于免疫层析法^[8]。采用等梯度洗脱模式，可实现AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂ 4种毒素的基线分离，保留时间无干扰，分离效果与已有C18柱优化研究结果一致^[9]。方法验证结果显示，6次平行测定中4种黄曲霉毒素的相对标准偏差（RSD）均<1.5%，精密度验证试验的回收率为80.2%～89.5%，结果波动范围（±4.65%）显著小于国际食品法典委员会规定的±15%，方法稳定性良好。综上，该方法准确、稳定、重复性佳，可为食品中多组分黄曲霉毒素污染风险评估提供可靠技术支撑，适用于粮食加工企业质量控制及市场监管检测需求。

参考文献

原文顺序 | 文献年度倒序 | 文中引用次数倒序

[1]	GB 2761—2017 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量 [S].

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