黄花菜（Hemerocallis citrina）为百合科萱草属多年生宿根草本植物。其是特有的经济蔬菜，在山东、湖南、甘肃、山西、陕西等地种质资源丰富，栽培历史悠久。‘毓桦一号'黄花菜（品种权号：CNA20231003003）是山东省聊城市聊河农业科技有限公司经过多年选育而成的特早熟鲜食黄花菜品种，该品种上市时间早，分蘖率高，抗病性强，花蕾肥厚，产量大，耐运输，鲜菜质量好。鲁西及周边地区一年采收两茬，日光温室首茬上市时间最早在2月上旬，大批量上市在3月上旬，采收期45 d；第二茬9月中旬上市，采收期30 d。‘毓桦一号'黄花菜鲜菜采收有效避开了全国黄花菜市场采摘高峰期，并且与当地露地栽培黄花菜品种实现错期上市，市场需求好，价格稳定、效益高。
黄花菜的传统繁殖方法为分株和种子繁殖，繁殖过程中易传染病毒和其他土壤病害，繁殖系数低，植株长势弱，病毒病危害大，影响了黄花菜种植规模的扩大[1]。侵染黄花菜的病毒主要有黄花菜花叶病毒（Hemerocallis mosaic virus，HeMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等。病菌主要有镰刀菌、丝核菌等[2]。黄花菜连年种植易引发病虫害频发、土壤板结等问题，加之化肥农药施用不当，一定程度上影响菜农种植效益与生产积极性[3]。
依托植物脱毒组培快繁技术繁育的黄花菜种苗，在遗传上与母株保持一致，可稳定遗传优良性状，增强植株抗性，同时打破季节限制，提升苗木整齐度。优质高效地实现种苗快速繁殖，有利于黄花菜种苗规模化生产[4-5]。左高雅[6]以‘大同黄花'（Hemerocallis citrina cv.‘Datong Huanghua'）为试验材料，筛选了组织培养的外植体、消毒条件，以花葶为外植体的接种方式、储存时间、培养基类型等主要因素，对花葶外植体进行愈伤组织诱导培养、愈伤组织增殖培养、芽的分化培养、生根培养、炼苗移栽5个阶段进行研究，探索了其快速繁殖的关键技术，建立了一套完整的黄花菜组培快繁体系。宋雪莲[7]以‘健壮利兰'‘浅紫荷'‘BedofRoses'‘PinkEmbers'‘耀辉'5个品种多倍体萱草的花葶分蘖结节处茎段为外植体材料，对多倍体萱草进行组织培养，系统建立了工厂化生产快速繁殖技术体系。‘毓桦一号'黄花菜茎尖脱毒组培快繁系统的构建不仅能够建立稳定高效的植物再生体系，也为其在实际生产中的应用和分子育种等相关研究提供技术支撑。但目前关于该品种黄花菜的脱毒组培快繁技术体系的建立暂未见相关报道。
本研究以‘毓桦一号'黄花菜茎尖为外植体，筛选外植体的最佳消毒方式，茎尖愈伤组织诱导、增殖培养、不定芽诱导分化、生根诱导培养的最适培养基配方，初步建立脱毒组培快繁系统，为‘毓桦一号'黄花菜种苗的脱毒快繁，工厂化育苗提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料选自山东省聊城市东昌府区韩集镇聊河农业科技有限公司的黄花菜种植基地。于3月采集未萌芽的黄花菜宿根苗，放入（39±1）℃恒温培养箱内进行培养，模拟自然光照，40 d后取出黄花菜植株备用。
1.2 外植体的消毒处理与接种
剪去经过热处理的黄花菜宿根苗老根，去掉根冠和表皮，剥去外层叶片直至露出黄白色的短缩茎，再用洗涤剂清洗干净，包上纱布，在流水下冲洗12 h。后将短缩茎放入超净工作台，从下往上用75%酒精棉擦拭2遍，消毒30 s，无菌水冲洗1遍，选择NaClO、灭菌时间2个因素，每个因素设置3个水平，其中NaClO浓度分别为3%、5%、7%，灭菌时间分别为15、20和25 min，共9个处理，每个处理后用无菌水冲洗5遍。每个处理20瓶，每瓶放置1个外植体，每个处理均设置3次重复。NaClO消毒液中加入表面活性剂0.5%吐温80，灭菌过程中不断轻摇无菌瓶，以增强灭菌效果。用解剖针在双目解剖镜下完整地取下茎尖0.3～0.5 mm的生长点，再接入配制好的诱导培养基内进行培养。接种后，先进行7～10 d的暗培养，芽点萌发，下端产生愈伤组织后进行光照培养，培养15 d后统计外植体污染率和成活率，计算如式（1 ）～（2 ）。
污染率（%）=污染的外植体数/接种的外植体数×100
成活率（%）=成活的外植体数/接种的外植体数×100
1.3 愈伤组织脱分化诱导
以经消毒的茎尖分生组织为外植体，以MS培养基作为脱分化诱导基础培养基，配置6-苄氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）与2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）不同浓度水平的组合，设计11个脱分化诱导培养基配方，具体如下：A1，0.5 mg/L 6-BA；A2，1.0 mg/L 6-BA；A3，1.5 mg/L 6-BA；A4，2.0 mg/L 6-BA；A5，2.5 mg/L 6-BA；B1，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；B2，1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；B3，1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；C1，0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D；C2，0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D；C3，1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D。每个处理20瓶，每瓶放置1个外植体，每个处理均设置3次重复。培养40 d后，观察愈伤组织生长状态，统计愈伤组织诱导率，计算如式（3） 。
愈伤组织诱导率（%）=诱导出愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100
1.4 愈伤组织的不定芽分化增殖培养
将愈伤组织（1.0 cm×1.0 cm）接种于不定芽分化增殖培养基上继续培养，不定芽分化增殖培养基采用MS培养基，配置6-BA、NAA不同浓度水平的组合，设计9个培养基配方，具体如下：D1，0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；D2，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；D3，0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；E1，1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；E2，1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；E3，1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；F1，1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；F2，1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；F3，1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。每个处理20瓶，每瓶放置1个外植体，每个处理均设置3次重复。培养20 d后，观察并记录各处理组中不定芽的分化情况和同步增殖情况，增殖系数、不定芽诱导率计算如式（4 ）～（5 ）。
愈伤组织增殖系数=形成愈伤组织总数/转接愈伤组织数
不定芽诱导率（%）=分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100
1.5 不定芽生根诱导培养
将芽长2.0～3.0 cm的不定芽切成单株转入生根诱导培养基，利用MS和1/2 MS培养基为基础培养基，选择不同浓度梯度的吲哚丁酸（IBA和NAA组合使用，共9个处理，具体如下：G1，MS培养基+0.1 mg/L NAA；G2，MS培养基+0.2 mg/L NAA；G3，MS培养基+0.5 mg/L NAA；G4，MS培养基+ 0.6 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA；G5，MS培养基+ 0.6 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA；G6，MS培养基+ 0.6 mg/L IBA+0.15 mg/L NAA；H1，1/2 MS培养基+ 0.1 mg/L NAA；H2，1/2 MS培养基+0.2 mg/L NAA；H3，1/2 MS培养基+0.5 mg/L NAA。每个处理20瓶，每瓶放置6株单株苗，每个处理均设置3次重复。培养20 d后以不定芽新生根刚触及组培瓶底为宜，观察记录组培苗生根情况，统计生根率和平均生根数，生根诱导率计算如式（6） [8]。
生根诱导率（%）=生根组培苗数/转接不定芽数×100
1.6 组培核心苗病毒检测
采用多重RT-qPCR荧光检测技术，分别利用由山东舜丰生物科技有限公司生产的黄花菜花叶病毒RT-qPCR检测试剂盒、黄瓜花叶病毒RT-qPCR检测试剂盒、烟草花叶病毒RT-qPCR检测试剂盒检测‘毓桦一号'黄花菜组培核心苗中HeMV、CMV、TMV。检测结果“阴性”表示样本不含有该病毒，阳性样本均有对应的Ct值，病毒含量由Ct值大小判定。样本病毒检测Ct值≤30为强阳性（即病毒含量高），Ct值>30为弱阳性（即病毒含量低），且病毒含量越高的样本Ct值越低。
1.7 数据统计
试验数据的统计分析采用Excel和SPSS 30软件。
2 结果与分析
2.1 ‘毓桦一号'黄花菜外植体消毒配方筛选
由表1可知，随着NaClO浓度的升高，污染率逐渐降低，成活率先升高后降低，以5% NaClO处理组的效果较好。在5% NaClO处理下，随着处理时间的延长，污染率逐渐降低，成活率先升高后降低。其中，消毒20 min处理组外植体污染率为15.00%，显著低于消毒15 min处理组（31.67%）（P<0.05）；消毒20 min处理组外植体成活率为80.00%，与15、25 min处理组差异无统计学意义（P>0.05）。综合来看，采用75%乙醇消毒30 s+5% NaClO消毒20 min效果最佳，污染率较低，且成活率最高。
表1 不同NaClO浓度和消毒时间对外植体污染率及成活率的影响 |
| 处理 | NaClO 浓度/% | 消毒时间/min | 污染率/% | 成活率/% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 15 | 55.00±0.09 a | 26.67±0.03 cd |
| 2 | 3 | 20 | 35.00±0.10 b | 30.00±0.17 cd |
| 3 | 3 | 25 | 16.67±0.03 cd | 65.00±0.15 ab |
| 4 | 5 | 15 | 31.67±0.08 b | 68.33±0.33 ab |
| 5 | 5 | 20 | 15.00±0.09 cd | 80.00±0.23 a |
| 6 | 5 | 25 | 15.00±0.09 cd | 71.67±0.21 ab |
| 7 | 7 | 15 | 21.67±0.08 bc | 55.00±0.09 abc |
| 8 | 7 | 20 | 11.67±0.08 cd | 43.33±0.03 bcd |
| 9 | 7 | 25 | 6.67±0.06 d | 18.33±0.08 d |
|
2.2 脱分化诱导培养基的筛选
由表2可知，C3培养基的黄花菜愈伤组织诱导率最高，为93.33%，愈伤组织呈暗黄偏白，硬脆易褐化。A5培养基的茎尖愈伤组织诱导率达91.67%，较C3培养基略低（P>0.05），但愈伤组织呈淡黄绿色或淡绿色、硬脆、致密、干燥，生长较好。A4培养基的茎尖愈伤组织诱导率达81.67%，愈伤组织呈绿色、少量白色、致密干燥、坚硬易脆。综合来看，A5培养基（MS+2.5 mg/L 6-BA）为最适的脱分化诱导培养基。
表2 不同脱分化诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响 |
| 编号 | 愈伤组织 诱导率/% | 愈伤组织生长状态 |
|---|---|---|
| A1 | 15.00±0.09 d | 白色，颜色稍暗，松软湿润 |
| A2 | 28.33±0.10 cd | 淡黄色，白色，松软 |
| A3 | 51.67±0.14 bc | 淡白色，松干微褐，长势一般 |
| A4 | 81.67±0.24 a | 绿色，白色，致密干燥，硬脆 |
| A5 | 91.67±0.21 a | 淡黄绿色或淡绿色，质地较硬，脆而致密，干爽，长势较佳 |
| B1 | 21.67±0.08 d | 黄色，少量白色，松软湿润 |
| B2 | 35.00±0.13 bcd | 绿色，少量白色，致密干爽，质地较硬，易脆 |
| B3 | 55.00±0.05 b | 绿色，少量白色或淡玫红色，密而干燥，质硬而脆，稍呈褐黄色 |
| C1 | 46.67±0.16 bc | 淡黄色，白色，松软湿润 |
| C2 | 53.33±0.08 bc | 淡白色，硬脆干燥松散 |
| C3 | 93.33±0.06 a | 暗黄偏白，硬脆，易褐化 |
2.3 愈伤组织增殖培养和不定芽分化培养基筛选
培养10 d左右的愈伤组织表面有浅黄绿色芽点冒出（图1B），20 d后，芽点长成翠绿幼嫩的簇状叶丛。9种培养基中，E3培养基中大部分能形成新的愈伤组织，呈绿色或黄绿色，愈伤组织增殖系数最高，为3.9，不定芽诱导率最高达85.00%，但形成的不定芽较密，叶片细长卷曲，长势较弱（表3）。E2培养基中多数能形成新的愈伤组织，呈绿色或黄绿色（图1A）；愈伤组织增殖系数为3.6，稍低于E3培养基，不定芽诱导率达81.67%，稍低于E3，但形成的不定芽主干较粗，叶片挺拔直立，长势旺（图1C）。综合来看，愈伤组织不定芽分化增殖的最适培养基为E2培养基（MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）。
表3 不同增殖培养基对愈伤组织增殖和不定芽分化的影响 |
| 编号 | 愈伤组织增殖系数 | 不定芽诱导率/% | 生长状态 |
|---|---|---|---|
| D1 | 0 | 0±0 d | 原愈伤组织褐化枯死，边缘未有新的愈伤组织形成 |
| D2 | 1.2 | 11.67±0.10 cd | 部分形成新的愈伤组织，暗黄白色，形成不定芽较小，叶片偏黄至枯死，长势差 |
| D3 | 1.9 | 21.67±0.06 bcd | 部分形成新的愈伤组织，黄色或黄绿色，部分形成不定芽较小，叶片偏黄，长势弱 |
| E1 | 2.1 | 45.00±0.20 abc | 部分形成新的愈伤组织，呈黄色或黄绿色，部分形成不定芽，叶片稍小且细长 |
| E2 | 3.6 | 81.67±0.38 a | 多数形成新的愈伤组织，绿色或黄绿色，所形成的不定芽主干粗壮，叶片挺立 |
| E3 | 3.9 | 85.00±0.15 a | 大部分形成新的愈伤组织，绿色或黄绿色，形成的不定芽较密，叶片细长卷曲，长势弱 |
| F1 | 2.7 | 58.33±0.08 ab | 大部分形成新的愈伤组织，黄色，部分形成丛状不定芽，较小，叶片偏黄 |
| F2 | 2.9 | 78.33±0.49 a | 大部分形成大块新的愈伤组织，黄色，少部分形成不定芽，较小，叶片黄化干枯 |
| F3 | 3.3 | 70.00±0.17 a | 大部分形成大块新愈伤，黄白色，有极少量不定芽，叶片极易干枯褐化 |
2.4 不定芽生根诱导培养基筛选
由表4可知，接种9 d后组培苗底部有较短的白色根尖冒出，20 d后9种培养基中‘毓桦一号'黄花菜的组培苗大部分均可生根。G5、H3培养基的生根率高达100%（图2A）。当基础培养基为MS培养基时，IBA、NAA均对组培苗生根有一定的诱导作用，G5培养基组培苗生根率为100%，最早生根时间最短，根系较粗壮，韧性较大，呈辐射状生长，苗高增加较快（图2B～C）。当基础培养基为1/2 MS培养基时，组培苗在H3培养基中的生根率为100%，最早生根时间较短，根部呈黄白色，粗细适中，苗高增加较快。综合来看，G5培养基（MS+0.6 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA）为最佳的不定芽生根诱导培养基。
表4 不同生根诱导培养基对不定芽生根条数和生根率的影响 |
| 编号 | 平均生根数/条 | 生根率/% | 不定根生长状态 |
|---|---|---|---|
| G1 | 1.7 | 82.00±0.04 d | 最早生根时间很长，呈现出黄白色，数量较少且较短 |
| G2 | 2.5 | 87.33±0.09 cd | 最早生根时间长，黄白色，较易折断 |
| G3 | 2.8 | 91.00±0.03 bc | 最早生根时间较长，呈辐射状生长，黄绿色，粗细适中 |
| G4 | 3.1 | 95.67±0.05 ab | 最早生根时间较短，黄绿色，根系细长，后期多呈卷曲状 |
| G5 | 5.2 | 100±0 a | 最早生根时间较短，黄绿色，根系粗大，韧性较大，呈辐射状生长 |
| G6 | 4.5 | 98.00±0.02 ab | 最早生根时间较短，呈黄白色，根粗壮短小，脆嫩，易断根 |
| H1 | 2.6 | 90.67±0.08 bc | 最早生根时间较长，黄白色，少量短根 |
| H2 | 3.5 | 98.00±0.02 ab | 最早生根时间较短，呈辐射状生长，后期杂乱无序，黄白色，粗细适中 |
| H3 | 4.0 | 100±0 a | 最早生根时间较短，根部呈黄白色，粗细适中，具有较强的韧性，呈放射状生长 |
2.5 检测脱毒组培苗脱毒效果
由表5可知，HeMV检测结果均为阴性，表明所有检测样本中均未发现HeMV，脱毒率达到100%。CMV检测结果显示，样本7的Ct值为32.9，超过了临界值30，显示为弱阳性，其余的19个样本均未检测到CMV，样本呈现为阴性，脱毒率达95%。TMV检测结果显示，样本18的Ct值为33.1，超过了临界值30，判断为弱阳性，其余19个样本均未检测到TMV，样本为阴性，脱毒率为95%。综合来看，通过热处理与茎尖脱毒的结合，可有效去除‘毓桦一号'黄花菜中的HeMV、CMV及TMV。
表5 脱毒组培核心苗病毒检测结果 |
| 样本编号 | HeMV | CMV | TMV |
|---|---|---|---|
| 1 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 2 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 3 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 4 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 5 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 6 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 7 | 阴性 | 32.9 | 阴性 |
| 8 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 9 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 10 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 11 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 12 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 13 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 14 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 15 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 16 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 17 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 18 | 阴性 | 阴性 | 33.1 |
| 19 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
| 20 | 阴性 | 阴性 | 阴性 |
3 结论与讨论
本研究以‘毓桦一号'黄花菜茎尖为外植体，研究不同消毒时间、消毒试剂浓度对外植体污染率和成活率，以及不同激素配比对茎尖愈伤组织诱导、增殖培养、不定芽分化、不定芽生根诱导培养的影响，并检测组培苗的脱毒效果。结果显示，采用75%乙醇消毒30 s+5% NaClO消毒20 min的‘毓桦一号'黄花菜茎尖处理效果最佳，组织污染率为15.00%，成活率达80.00%；最适脱分化诱导培养基为MS+2.5 mg/L 6-BA，愈伤组织诱导率达91.67%，愈伤组织为淡黄或淡绿色，长势良好；最适增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖系数大，愈伤组织与出苗协同连续，不定芽诱导率达81.67%；最适不定芽生根诱导培养基为MS+0.6 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA，不定根诱导率达100%，根系数量多，平均根长适中。采用多重RT-qPCR荧光检测技术，获得‘毓桦一号'黄花菜脱毒核心苗，脱毒率达95.00%。本研究认为，应用植物脱毒组培快繁技术，在大力提高黄花菜繁殖系数和速度的同时，可实现‘毓桦一号'黄花菜脱毒，增强植株抗性，进而提高产品质量和产量。
左高雅等[6，9]研究表明，以幼嫩叶片为外植体，最佳消毒灭菌方式为75%乙醇灭菌30 s+0.1%升汞溶液灭菌10 min，可将污染率降低至14.58%；以幼嫩花葶为外植体，最佳消毒灭菌方式为75%乙醇灭菌30 s+0.1%升汞溶液灭菌10 min，可将污染率降低至16.67%，启动率达88.43%。杨丽莉等[10]研究认为，以萱草子房为外植体，最佳消毒灭菌方式为75%乙醇浸泡3～5 min+0.1%升汞灭菌15 min，无菌水冲洗3～4次。‘毓桦一号'黄花菜茎尖取材于土层下黄花菜茎基部层叶片包裹的黄白色短缩茎，因在土下可能会有大量细菌、真菌等，若前期消毒不彻底，可能导致外植体大量污染，甚至无法获得脱毒干净的愈伤组织。因此，通过用洗洁精清洗，纱布包裹在流水下冲洗12 h，用75%酒精棉从下向上擦拭2次，表面消毒30 s，再用5% NaClO进行长时间消毒，可有效降低污染率。
左高雅[6]研究表明，6-BA与NAA、2，4-D、噻苯隆（TDZ）配合使用均能诱导“大同黄花'愈伤组织，在0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+10.0 mg/L TDZ的MS培养基中出愈率较高。本试验结果表明，‘毓桦一号'黄花菜愈伤组织增殖与出苗协同连续。最适的增殖培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖系数大，不定芽诱导率达81.67%，幼苗茎秆粗壮，叶片绿色，长势旺盛，可实现愈伤组织增殖与不定芽分化同步进行，增殖继代周期20 d左右，增殖系数在3以上。宋雪莲[7]研究表明，不同基因型多倍体萱草的生根状况在同一植物生长调节剂组合上存在着较大差异，‘健壮利兰'‘耀辉'的最佳生根培养基为1/2 MS+0.4 mg/L NAA；‘浅紫荷'‘Pink Embers'的最佳生根培养基为1/2 MS+0.5 mg/L NAA；‘Bed of Roses'的最佳生根培养基为1/2 MS+0.6 mg/L NAA。本研究采用MS和1/2 MS培养基进行生根诱导培养，探究IBA、NAA不同配比对组培苗不定根诱导的影响，结果表明，MS+0.6 mg/L IBA+0.2 mg/L NAA为最适宜的生根诱导培养基，不定根诱导率高达100%，生根数量多，根长平均适中，这可能与黄花菜品种的差异性有关[11]。
由于本研究仅采用单一试验材料，且供试植物生长调节剂仅为6-BA、NAA、2，4-D和IBA，研究结果对其他黄花菜品种的适用性有待进一步验证。后续可进一步探索完善其组培脱毒快繁技术体系，如不同采样时间、采样部位对茎尖愈伤组织诱导的影响，不同糖源含量对增殖培养中增殖系数大小的影响等。本研究成果可为‘毓桦一号'黄花菜种苗脱毒快繁及工厂化育苗提供参考。