玛卡（Lepidium meyenii Walp.）为高原作物，其主要活性成分包括多糖、生物碱、多酚、甾醇及皂苷等，其中玛卡多糖（Maca polysaccharide，MCPC）为主要研究热点。该成分具备抗氧化、抗疲劳、增强机体免疫力等功效，相关生物活性研究已取得重要进展[1-2]。玛卡多糖粗提物中常含有蛋白质、色素及小分子杂质，这些杂质会影响多糖的纯度、结构及生物活性[3]。目前多糖常用的脱色技术包括活性炭法、过氧化氢法、柱层析法、离子交换树脂法及反胶束法等[4-5]，不同方法的脱色效果与适用性随条件不同存在差异。其中，大孔吸附树脂法因操作简便、效率稳定，可同步去除色素与蛋白质，脱色效果优良，在多糖脱色中应用广泛[5]。张子怡等[6]采用AB-8大孔树脂优化桔梗多糖脱色条件，获得93.82%的脱色率与79.88%的多糖保留率；李自霖等[7]选用FL-1大孔树脂对地参多糖进行脱色，脱色率达82.64%、多糖保留率为72.06%；朱勇等[8]采用D-301大孔树脂优化亳白芷粗多糖脱色工艺，脱色率与多糖保留率分别达到89.03%和82.14%。为优化玛卡多糖脱色工艺、提高多糖纯度，保留其天然特性与功能活性，本文选用D101型大孔吸附树脂，探究树脂用量、脱色时间、脱色温度3个因素对黑玛卡多糖色素脱除效果的影响，通过响应面法优化脱色工艺，并探究脱色前后黑玛卡多糖的体外抗氧化活性，为黑玛卡多糖的进一步开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
玛卡根茎原料购于云南省大理白族自治州中草药批发市场，经大理大学基础医学院左绍远教授鉴定为丽江黑玛卡根茎。
2，2-二苯基-1-苦基肼基自由基（DPPH）购自日本东京化成工业株式会社；D101型大孔吸附树脂、2，2'-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）购自上海麦克林生化科技股份有限公司；抗坏血酸（VC）、过硫酸钾（K2S2O8）购自中国国药集团化学试剂有限公司；其余试剂均为国产分析纯（AR）。
1.2 试验仪器
HC-2062型高速离心机购自安徽中科中佳科学仪器有限公司；BT-224S型电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发器购自上海亚荣生化仪器厂；SP-722型紫外可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；THZ-82型恒温振荡器购自上海天呈实验仪器制造有限公司；RXH-5-C型远红外节能鼓风循环不锈钢烘箱购自上海崇明实验仪器厂。
1.3 试验设计
1.3.1 单因素试验设计
称取多份玛卡粗多糖干粉（每份0.5 g），制备质量浓度为5.0 mg/mL的多糖供试液。以脱色率和多糖保留率为考察指标，分别探究充分溶胀的大孔吸附树脂用量（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g）、脱色时间（1、2、3、4、5 h）及脱色温度（20、30、40、50、60 ℃）对脱色效果的影响。每组设置3个平行样，考察单一因素时，固定温度40 ℃、脱色时间2 h、树脂用量2.0 g，于摇床中进行反应。
1.3.2 响应面优化设计
在单因素试验结果基础上，以玛卡多糖脱色率与保留率的综合评分（Y）为响应值，采用响应面法优化其脱色工艺，试验设计通过Design Expert 13.0统计软件完成，响应面试验因素及水平见表1。
表1 响应面试验因素及水平 |
| 水平 | 因素 | ||
|---|---|---|---|
| A大孔吸附树脂用量/g | B脱色时间/h | C脱色温度/℃ | |
| -1 | 1 | 1 | 40 |
| 0 | 2 | 2 | 50 |
| 1 | 3 | 3 | 60 |
1.3.3 体外抗氧化活性试验设计
采用DPPH自由基清除实验与ABTS自由基清除实验，评价脱色前、后玛卡多糖的体外抗氧化能力。
1.4 试验方法
1.4.1 玛卡多糖的提取工艺
称取1 000 g粉碎至40目的黑玛卡粉末，加入2倍体积石油醚加热回流脱脂（料液比1 000 g∶2 000 mL，提取2次，每次3 h），将滤渣干燥至恒重。取适量处理后的玛卡粉末置于纯水中，于70 ℃搅拌浸提多糖，在4 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液并减压浓缩至适宜体积。采用Sevage法（氯仿∶正丁醇为4∶1）去除蛋白后，向浓缩液中加入4倍体积无水乙醇，于4 ℃静置12 h，收集沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤1次，4 000 r/min离心15 min，弃去上清液，冷冻干燥后得到玛卡粗多糖。
1.4.2 标准曲线绘制
参照文献[9]方法并稍作优化，精确称取0.05 g无水葡萄糖标准品，配制浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖母液。分别准确吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖母液于试管中，各补加纯水定容至2.0 mL。将试管置于冰水浴中，缓慢加入4.0 mL 0.1%蒽酮—硫酸溶液，随后置于沸水浴中加热10 min；冷却至室温后，以蒸馏水为空白对照，在625 nm波长下测定吸光度。所得回归方程为Y=0.854 6X+0.008 1（R²=0.997 7），表明葡萄糖标准品质量浓度与吸光度值呈良好线性关系，可用于玛卡多糖质量浓度的测定。
1.4.3 玛卡多糖脱色率的测定
参照文献[8]的方法，称取0.5 g玛卡粗多糖，溶解于100 mL纯水中，充分溶解后，于4 000 r/min条件下冷冻离心5 min，收集上清液。取2 mL多糖上清液进行全波长扫描，结果显示其在340 nm波长处有最大吸收峰，故确定340 nm为后续检测波长，用于测定脱色前后样品溶液的吸光度（A）。多糖脱色率计算公式如下：
多糖脱色率R（%）=（）×100
式中，A1为脱色前玛卡多糖的A值，A2为脱色后玛卡多糖的A值。
1.4.4 玛卡多糖保留率的测定
参照文献[9]的方法，测定玛卡多糖溶液脱色前后的吸光度，将其代入葡萄糖标准曲线，计算得出玛卡多糖质量浓度；再将该质量浓度代入公式（2） ，计算多糖保留率。
多糖保留率D（%）=（）×100
式中，D表示多糖保留率（%）；C1为玛卡多糖脱色前的质量浓度（mg/mL）；C2为玛卡多糖脱色后的质量浓度（mg/mL）。
1.4.5 玛卡多糖脱色效果的评价
综合评分Y=（R+D）/2
式中，Y为玛卡多糖脱色率和保留率的综合评分；R为玛卡多糖脱色率（%）；D为玛卡多糖保留率（%）。
1.4.6 大孔吸附树脂的预处理
参照文献[11]的方法并稍作优化，先用去离子水冲洗大孔吸附树脂3次，去除漂浮杂质后收集树脂。加入2倍体积95%乙醇浸泡24 h，待树脂充分溶胀后收集，依次用1倍体积5% HCl溶液、1倍体积NaOH溶液各浸泡4 h，以去除酸性有机杂质及部分酯类残留；再用1倍体积95%乙醇浸泡4 h，活化树脂表面非极性基团（如苯环），增强其对疏水性化合物的吸附能力；最后用去离子水洗涤树脂至pH呈中性，备用。
1.4.7 玛卡多糖对DPPH自由基清除作用
参照文献[12]的方法，分别配制浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的脱色前、脱色后玛卡多糖样品溶液，各取2.0 mL样品溶液，加入2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混匀后于室温避光反应30 min。空白组以2.0 mL去离子水替代样品溶液，其余操作同样品组；阳性对照组将VC配制成上述相同浓度，操作方法与样品组一致。在517 nm波长下测定各组吸光度（A），并计算脱色前、脱色后玛卡多糖对DPPH自由基的清除率。
R （）100
式中，R为DPPH自由基清除率（%）；A1，在517 nm处样品组或阳性对照组的A值；A2，2 mL去离子水加玛卡多糖或VC溶液的本底A值；A0，空白组的A值。
1.4.8 玛卡多糖对ABTS自由基清除作用
参照文献[13]的方法，配制7.4 mmol/L ABTS二铵盐储备液与2.6 mmol/L K2S2O8储备液，取两种储备液等体积（1∶1）混合，于室温避光条件下静置12 h。使用前，用pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）稀释该混合液，至734 nm波长下吸光度为0.70±0.02，制得ABTS+工作液。分别配制0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的脱色前、脱色后玛卡多糖样品溶液，各取0.4 mL样品溶液与4.0 mL ABTS+工作液混匀，避光反应6 min，每组设3个平行样。以VC为阳性对照，空白组以2 mL PBS替代样品溶液，其余操作均同样品组，在734 nm波长下测定各组吸光度，计算脱色前、脱色后玛卡多糖对ABTS自由基的清除率。
S（%）（）100
式中，S为ABTS自由基清除率（%）；A1，在734 nm处样品组或阳性对照组的A值；A2，2 mL去离子水加玛卡多糖或VC溶液的本底A值；A0，空白组的A值。
1.5 数据统计与分析
试验数据采用Origin 2024软件进行统计学分析，Design Expert 13.0软件进行响应面模拟及方差分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 树脂用量对玛卡多糖脱色效果的影响
2.1.2 脱色时间对玛卡多糖脱色效果的影响
2.1.3 脱色温度对玛卡多糖脱色效果的影响
2.2 响应面试验
表2 响应面试验设计 |
| 序号 | A大孔吸附树脂用量/ （g/mL） | B脱色时间/h | C脱色温度/℃ | D多糖脱色率/% | Y多糖保留率/% | 综合评分/分 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 0 | 0 | 0 | 56.5 | 51.5 | 54.00 |
| 2 | 1 | 0 | -1 | 42.1 | 31.1 | 36.60 |
| 3 | 0 | -1 | -1 | 53.9 | 45.9 | 49.90 |
| 4 | -1 | 0 | -1 | 45.8 | 55.5 | 50.65 |
| 5 | 1 | 1 | 0 | 35.1 | 24.1 | 29.60 |
| 6 | -1 | 0 | 1 | 34.9 | 49.5 | 42.20 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 53.0 | 52.3 | 52.65 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 54.7 | 53.1 | 53.90 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 43.7 | 44.1 | 43.90 |
| 10 | 0 | 0 | 0 | 53.9 | 53.2 | 53.55 |
| 11 | 0 | 1 | 1 | 45.0 | 33.2 | 39.10 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 54.8 | 49.9 | 52.35 |
| 13 | 1 | 0 | 1 | 34.7 | 34.1 | 34.40 |
| 14 | 0 | -1 | 1 | 54.9 | 41.6 | 48.25 |
| 15 | -1 | -1 | 0 | 35.4 | 57.7 | 46.55 |
| 16 | -1 | 1 | 0 | 37.9 | 55.0 | 46.45 |
| 17 | 1 | -1 | 0 | 50.8 | 24.6 | 37.70 |
表 3 试验方差分析 |
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| R2 =0.986 6，R2 Adj =0.969 4 | ||||||
| 模型 | 921.45 | 9 | 102.38 | 57.39 | <0.000 1 | *** |
| A | 282.63 | 1 | 282.63 | 158.41 | <0.000 1 | *** |
| B | 68.15 | 1 | 68.15 | 38.20 | 0.000 5 | ** |
| C | 36.55 | 1 | 36.55 | 20.49 | 0.002 7 | ** |
| AB | 16.00 | 1 | 16.00 | 8.97 | 0.021 0 | * |
| AC | 9.77 | 1 | 9.77 | 5.47 | 0.051 9 | |
| BC | 2.48 | 1 | 2.48 | 1.39 | 0.276 9 | |
| A2 | 324.95 | 1 | 324.95 | 182. 14 | <0.000 1 | *** |
| B2 | 83.75 | 1 | 83.75 | 46.95 | 0.000 2 | ** |
| C2 | 53.74 | 1 | 53.74 | 30.12 | 0.000 9 | ** |
| 残差 | 12.49 | 7 | 1.78 | |||
| 失拟项 | 10.10 | 3 | 3.37 | 0.064 3 | ||
| 纯误差 | 2.39 | 4 | 0.598 3 | 5.63 | 不显著 | |
| 总离差 | 933.93 | 16 | ||||
|
2.2.1 各因素交互作用对玛卡多糖脱色率和多糖保留率综合评分的影响
2.2.2 验证试验
采用Design-Expert 13.0软件预测玛卡多糖最佳脱色工艺参数：D101大孔吸附树脂1.8 g、脱色时间1.56 h、脱色温度47.65 ℃，此时预测多糖色素去除率55.36%、多糖保留率53.89%、综合评分54.63%。结合实际试验条件，将工艺参数调整如下：粗多糖质量浓度5.0 mg/mL，D101大孔吸附树脂2 g、脱色时间1.5 h、脱色温度50 ℃，脱色1次。验证试验结果显示，多糖脱色率55.4%、保留率53.56%、综合评分54.48%，与预测值基本一致，表明利用D101大孔吸附树脂对黑玛卡多糖进行脱色可行。
2.3 玛卡多糖体外抗氧化活性研究
2.3.1 玛卡多糖在脱色前后对DPPH自由基的清除作用
由图5可知，玛卡多糖对DPPH自由基的清除作用与其浓度呈一定量效关系。当多糖浓度为4.0 mg/mL时，脱色前的清除率达83.76%，而脱色后清除率降至51.1%。推测脱色过程可能去除了玛卡多糖中可与DPPH自由基反应的活性成分，进而导致其DPPH自由基清除能力下降，表明脱色工艺可能会降低黑玛卡多糖的DPPH自由基清除活性。
2.3.2 玛卡多糖在脱色前后对ABTS自由基清除作用
3 结论
本研究采用D101型大孔吸附树脂对黑玛卡多糖进行脱色试验，结合响应面法优化脱色工艺，确定最佳工艺条件为粗多糖质量浓度5.0 mg/mL、树脂用量2.0 g、脱色时间1.5 h、脱色温度50 ℃、脱色1次。验证试验结果显示，多糖脱色率55.4%、保留率53.56%、综合评分54.48%，与预测值基本一致，表明该脱色工艺稳定可行。抗氧化测试表明，玛卡多糖对DPPH、ABTS自由基的清除作用与多糖浓度呈明显量效关系，当多糖浓度为4.0 mg/mL时，脱色前自由基清除效果接近VC对照组；脱色后多糖仍保持较好的抗氧化活性，尤其在ABTS自由基清除方面表现突出。本研究建立的稳定脱色工艺，为黑玛卡多糖的纯化、天然抗氧化剂开发提供参考。