地参（Lycopus lucidus）是一种传统中药材，主要分布于中国西南地区，其鳞茎和叶部含有丰富的多糖类活性成分。地参多糖作为地参药材的主要活性成分，具有抗氧化和抗肿瘤等多种生物学活性[1-2]，在改良土壤环境、增强畜禽抗病能力方面展现出较高的应用潜力。近年来，肝细胞癌年龄标准化发生率、流行率和死亡率呈下降趋势，整体预后效果较差[3-4]。肝癌的发生与慢性病毒性肝炎、酒精性肝病以及代谢相关因素密切相关，其高侵袭性和耐药性使手术、化疗等常规治疗效果有限，亟需探索新型药物和辅助疗法以改善患者生存质量[5]。熊伟[6]研究表明，地参多糖能够增强小鼠体液免疫功能，可能是一种潜在的免疫调节剂。此外，刘涵[7]研究发现，地参多糖能通过调节胰岛素信号传导途径的关键分子表达，发挥抗糖尿病的生理功能。
相关研究已从地参根茎中提取并纯化了一种新型多糖LLP-1，其主要的单糖组成为葡萄糖、半乳糖和果糖。体外试验证实，LLP-1能显著抑制肝癌细胞增殖并促进凋亡，表现出潜在的抗肝癌作用[4]，但其具体的分子靶点及其与临床预后的相关性尚不清楚。本研究运用网络药理学和分子对接技术，通过预后模型构建和GO、KEGG富集分析揭示其与患者预后和肿瘤微环境的联系，为地参多糖LLP-1的功能性食品开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 靶点预测与基因筛选
基于地参多糖LLP-1的化学结构，利用TargetNet、SwissTargetPrediction和SEA数据库预测其潜在靶点，汇总去除重复后获取相关潜在作用靶点。同时从TCGA数据库提取肝癌的RNAseq数据并提取TPM格式数据以及临床数据，通过COX回归分析（R包：survival [3.3.1]）筛选出与患者预后显著相关的基因（P<0.05），并与LLP-1预测靶点进行交集分析，确定共同靶点。
1.2 蛋白质互作网络构建
利用STRING数据库构建LLP-1相关靶点与肝癌预后靶点的蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，设置置信度阈值>0.400，将得到的PPI网络导入Cytoscape软件中进行可视化分析。
1.3 预后模型构建
基于PPI网络筛选出的相关靶点，使用LASSO回归模型通过十折交叉验证确定最优参数lambda值（R包：glmnet [4.1.7]），筛选出核心预后靶点，构建预后预测模型。使用时间依赖ROC（R包:timeROC [0.4]，ggplot2 [3.4.4]）评估模型的预测能力（AUC：曲线下面积）。使用和弦图评估核心靶点与肝癌的相关性（R包：circlize [v0.4.1]），靶点之间使用带权重的弧线连接，弦的宽度表示变量间的关系强度。
1.4 GO、KEGG富集分析
使用Metascape数据库对核心靶点进行GO和KEGG富集分析，识别与LLP-1抗肝癌作用相关的生物学过程和信号通路，P值校正后筛选显著富集条目（P<0.05）。使用微生信平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）对GO富集分析排名前5或前4和KEGG富集分析排名前9的条目进行可视化。
1.5 分子对接模拟
使用AutoDock Vina软件进行分子对接模拟，评估LLP-1与核心靶蛋白的结合亲和力。从Protein Data Bank数据库中下载靶蛋白三维结构，以ChemDraw软件优化后的LLP-1分子结构作为配体。设置网格盒覆盖活性位点，记录结合能（kJ/mol），结合能<-20.92 kJ/mol视为有效结合，对接结果使用Discovery Studio 2019 Client软件进行可视化。
2 结果与分析
2.1 LLP-1抗肝癌核心靶点筛选及预后模型构建
通过公共数据库对LLP-1进行靶点预测，共获得85个潜在靶点。从TCGA数据库中筛选出6 767个与肝癌预后相关的基因（P<0.05）。将LLP-1潜在靶点与肝癌预后基因进行交集分析，得到19个共同靶点（图1A）。利用STRING数据库构建PPI网络，共获得11个靶点和24条边，其中度值较高的节点包括CDK1、CDK2等，表明这些靶点在网络中发挥核心作用（图1B）。通过LASSO回归模型筛选出LGALS3、CCNA2、APH1A、CDK1、CDK2和HSP90AA1共6个与预后相关的核心靶点（图1C），这些核心基因用于构建预后模型。时间依赖ROC分析显示模型在1年、3年和5年的AUC值均>0.6，表明模型具有中等预测性能（图1D）。此外，和弦图结果显示，所有核心靶点均与肝癌呈正相关（图1E）。
2.2 GO和KEGG富集分析
由图2可知，对6个核心靶点进行GO和KEGG富集分析，GO富集分析共获得544个条目，其中生物过程有416个条目，主要富集于DNA代谢过程和细胞周期相关过程；细胞组分有59个条目，主要与细胞周期调控蛋白复合物相关；分子功能有69个条目，主要与组蛋白和丝氨酸/苏氨酸激酶功能相关。KEGG通路富集共获得36个条目，其中细胞周期富集程度最高，还包括p53、FoxO、AMPK等与细胞周期调控相关的信号通路。这些富集结果表明，LLP-1可能主要通过调控细胞周期相关过程发挥抗肝癌作用。
2.3 分子对接
3 结论与讨论
程婷婷等[8]研究发现，地参多糖能够激活小细胞肺癌A549细胞中半胱氨酸、天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）途径，诱导细胞凋亡发生。类似的促凋亡效应在黑色素瘤A375细胞中也被观察到，并且地参多糖还能下调A375细胞中的细胞周期相关蛋白，将细胞周期阻滞在G0/G1期，提示其具有广泛的抗肿瘤活性[9]。本研究基于LLP-1的结构特征进行潜在靶点预测，并从TCGA数据库通过COX回归分析筛选与肝癌预后相关的基因与LLP-1靶点进行交集分析；利用STRING数据库构建蛋白质互作网络，结合LASSO回归分析筛选核心靶点，构建预后模型，系统探讨了地参多糖LLP-1与临床预后相关性，筛选出与肝癌预后密切相关的6个核心靶点（LGALS3、CCNA2、APH1A、CDK1、CDK2、HSP90AA1）。其中CDK1、CDK2和CCNA2作为细胞周期激酶，在肝癌中促进G2/M期转换，其表达抑制可诱导细胞周期阻滞和凋亡发生[10]。Xu等[11]研究发现，蝉草多糖通过抑制CCNA和CDK2表达，上调P53水平，诱导宫颈癌细胞周期阻滞和凋亡。Chu等[12]研究发现，马尾松多糖能下调肝癌细胞中CDK1和Cyclin B表达，上调p53和p21水平，诱导G2/M期阻滞。此外，分子对接结果表明，LLP-1与3种细胞周期激酶具有较好的亲和力。因此，CDK1、CDK2和CCNA2可能是LLP-1抑制肝癌细胞周期的关键靶点。
尽管本研究整合了网络药理学、预后模型和分子对接，但仍存在一定局限性。首先，基于数据库进行的靶点预测可能存在偏差；其次，LLP-1对肝癌的实际抑制效果需进一步确认。未来可通过小鼠模型或临床样本验证LLP-1的抗肝癌机制，并探索其与其他抗癌药物的联合应用。本研究为LLP-1作为功能性食品的开发提供参考。