锦鲤（Cyprinus carpio）属鲤科，鲤亚科，鲤属，是经过人工改良的观赏鱼类，具有体型大、色彩和类型丰富、抗逆性强以及性情温顺等特点[1-2]。锦鲤良种选育过程烦琐复杂，是一项专业性、综合性较强的技术工作[3-4]，需要不断地筛选以获得具有高观赏价值的品种。郭珺等[5]和董在杰等[6]研究表明，目前锦鲤新品种的培育主要依赖人工选育和杂交技术，在培育与养殖过程中主要以锦鲤的颜色和色斑进行挑选。其基因型分化明显，遗传背景复杂，体色变化多样，致使具备稳定遗传体色的优质个体较少[7]。
雌核发育是一种仅由卵繁育后代的技术[8]，人工诱导雌核发育技术能够加快优良基因的纯合，快速建立纯系，缩短育种进程，对锦鲤体色研究和新品种选育具有重要意义[9-10]。线粒体DNA（mtDNA）是独立于核基因组的遗传物质，是结构高度紧凑的共价双链闭环分子[11]，遵从母系遗传，具有良好的生物学和遗传学特性，如单拷贝、无重组、进化速率适中、具有一定多态性等，是鱼类进化遗传研究的有力工具[12]。动物线粒体基因组包含2个核糖体RNA，分别为12S rRNA和16S rRNA，16S rRNA在鱼类及其他生物的分类和系统发育研究中已有广泛应用，被认为是有效的分子标记[13-16]。本研究以雌核发育的纯红、纯白、纯黑3种锦鲤为研究对象，基于线粒体16S rRNA基因分析锦鲤间的遗传差异，探讨品种间的亲缘关系，为雌核发育锦鲤的种群遗传、适应性进化、人工育种和养殖等研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
3种由雌核发育而来的纯白锦鲤、纯黑锦鲤、纯红锦鲤，均为实验人员在安庆师范大学水生生物保护与水生态修复安徽省高校研究技术中心培育。采用马来酸地欧酮（DOM）和促黄体释放激素类似物（LRH-A2）混合一次性注射法对母本锦鲤和父本鲤鱼进行人工催产，注射剂量：LRH-A2 3.0 μg/kg+DOM 1.0 mg/kg，雄鱼剂量减半。催产后放入20～22 ℃水中培育14 h左右。待雌鱼发情后，将其捞起，人工挤卵至玻璃皿中，于冰箱避光低温保存。用湿毛巾包裹父本鲤鱼鱼体并固定，将鱼的腹部朝上平放，另一边用柔软干净的毛巾擦干鱼腹，轻按腹部，使得白色精液随之流出（所取得的精液在观察时应呈现为乳白色，具有较高的黏稠度，遇水能够快速散开）。取部分精液用Hank’s溶液稀释（精液∶Hank’s溶液为1∶4）并轻轻摇匀，使精液均匀平铺于培养皿底部。在避光条件下，将培养皿置于冰面上，用1支25 W的紫外线灯管照射处理精子20 min，灯管与精液面的距离为13.2 cm。照射过程中用摇床不停地缓慢摇动，使精液被均匀照射。静置后的精液与卵子进行干法授精，在20～22 ℃水中孵化。将卵子与灭活的精子在孵化盆中授精，并用洁净的羽毛轻轻搅拌混匀，待受精3 min 后，将受精卵放入40～42℃恒温振荡水浴锅中，热休克处理2 min 抑制受精卵第二极体排出，使受精卵染色体加倍，然后将处理后的受精卵放入20～22 ℃水中孵化，孵化用水需充分曝气。共挑选24尾样本，纯白锦鲤、纯黑锦鲤、纯红锦鲤各8尾，样本健康状况良好，游动稳健，无伤病，规格相近（0.2～0.3 kg）。
1.2 试验方法
1.2.1 样本总DNA的提取
分别取红、白、黑3种纯色锦鲤的尾鳍少许，使用上海生工生物工程股份有限公司的动物基因组DNA快速抽提试剂盒抽提线粒体DNA，-20 ℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增及目的基因序列测定
锦鲤尾鳍线粒体DNA 16S rRNA基因片段扩增所用特异性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。具体引物序列如下：16S-F，5′-CGCCTGTTTACCAAAAACAT-3′；16S-R，5′-CCGGTCTGAACTCAGATCA-3′。PCR反应体系为25.0 µL：ddH2O 8.5 μL、Taq Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环22次；反应结束后在72 ℃延伸5 min，最后16 ℃保存。PCR扩增所得目的DNA片段扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选条带表现较好的PCR产物送往上海生工生物工程股份有限公司进行纯化回收和序列测定。
1.2.3 序列分析和系统发育分析
测序结果使用BioEdit软件编辑并人工除去基因两端的少量不稳定序列，将整理后的目标序列在GenBank数据库中开展BLAST同源性比对。用MEGA 5.0软件[17]分析序列的碱基组成，计算群体间遗传距离，然后采用邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建单倍型系统发育树，采用序列数据集1 000次重复抽样检验的自展值（Bootstrap value）表示系统树各节点置信度。
2 结果与分析
2.1 PCR扩增结果
PCR扩增产物凝胶电泳图谱如图1所示，产物片段长度在750～1 000 bp，条带完整清晰、无杂带，满足测序要求。
2.2 序列分析
目标序列经BLAST同源性比对，确认得到967 bp的基因片段。3种纯色锦鲤16S rRNA基因A+T的平均含量为58.26%，高于G+C（41.74%）。表明A、T碱基在线粒体基因中占据主导，体现出鱼类线粒体基因的A、T偏向性。分别计算各品系的A+T含量，纯红锦鲤、纯白锦鲤和纯黑锦鲤分别为58.47%、57.78%和58.53%，三者无显著差异，表明不同品系间整体碱基偏好性一致。
经序列比对分析，纯红锦鲤、纯白锦鲤、纯黑锦鲤3个品系内所有个体的线粒体16S rRNA序列完全一致，各品系仅检测到1种单倍型，无品系内遗传差异。因此，后续遗传距离计算与系统发育树构建中，每个品系仅选取1条代表序列进行分析。
2.3 系统发育分析
纯红锦鲤与纯黑锦鲤之间的品系内遗传距离较近，为0.10%，结合鱼类线粒体16S rRNA基因的物种界定通用标准（种内遗传距离<2%，种间遗传距离>2%），二者品系内遗传距离远低于种内阈值，符合同一物种内不同品系的遗传特征；纯黑锦鲤与纯白锦鲤、纯白锦鲤与纯红锦鲤的品系间遗传距离分别为4.80%、5.00%，高于种内阈值，提示3种纯色锦鲤品系间存在明显的遗传分化。系统发育树（图2）显示，纯黑锦鲤与纯红锦鲤亲缘关系较近，二者先聚为一支，纯白锦鲤单独聚为一支。
图2 基于16S rRNA基因序列构建的NJ系统进化树分支节点上的数字为自展值，采用1000次重复抽样计算得到，用于评估各分支的可靠性；标尺0.01代表序列的遗传距离。Cyprinus carpio Gyno Black、Carassius auratus 、Cyprinus carpio Gyno Red、Cyprinus carpio、Carassius gibelio、Carassius langsdorfii、Carassius cuvieri、Carassius carassius、Carassioides acuminatus、Bangana acuminatus、Cyprinus carpio Gyno White、Sinocyclocheilus wenshanensis、Sinocyclocheilus grahami、Sinocyclocheilus bicornutus、Sinocyclocheilus furcodorsalis、Sinocyclocheilus anatirostris分别为纯黑锦鲤、鲫（金鱼）、纯红锦鲤、锦鲤、银鲫、兰氏鲫、库氏鲫、欧洲鲫、尖头鲫、洞庭华鲮、纯白锦鲤、文山金线鲃、葛氏金线鲃、双脚金线鲃、叉背金线鲃、鸭嘴金线鲃。 |
本研究中3种纯色锦鲤为人工诱导雌核发育的选育品系，并非自然物种，因此其遗传距离仅用于品系间遗传分化与亲缘关系分析，而非严格的物种界定；系统发育树的分支支持度（自展值）也验证了各分支的可靠性，进一步明确了3种锦鲤品系的分类地位。
3 结论与讨论
遗传距离分析显示，纯红锦鲤和纯黑锦鲤的遗传距离仅为0.10%，表明纯红锦鲤和纯黑锦鲤之间的遗传分化程度较小。可能是纯红和纯黑锦鲤在人工养殖和选育过程中，存在较多的基因交流，遗传背景高度相似。纯黑锦鲤与纯白锦鲤、纯白锦鲤与纯红锦鲤的品系间遗传距离分别为4.80%、5.00%，可能是3个锦鲤品系均经雌核发育繁育，遗传物质完全源自母本、无基因重组与种质交流，初始母本固有的遗传差异经雌核发育纯合固定，再加上纯白锦鲤体色调控基因存在特异性变异，最终导致其与纯黑、纯红锦鲤遗传距离偏大，亲缘关系较远并单独聚为一支。此外，本研究发现，鲫属（Carassius）与鲤属（Cyprinus）有一定亲缘关系，在进化早期可能有共同祖先，随时间推移，因生态位分化、地理隔离等因素，基因逐渐变异，形成不同属特征。纯红、纯白、纯黑锦鲤作为鲤属成员，和鲫属鱼类在进化树上的距离，反映了鲤科鱼类在漫长进化历程中的演化路径和分支情况。
综上，本研究以线粒体16S rRNA基因为分子标记，对雌核发育的纯红、纯白、纯黑3种锦鲤进行遗传系统发育分析，明确了纯红、纯黑锦鲤与普通鲤鱼的亲缘关系，以及纯白锦鲤的相对独立进化地位，这不仅为深入了解锦鲤进化历程、遗传多样性提供理论依据，更明确其亲缘关系，为锦鲤优质体色品系的选育奠定了基础。后续研究可拓展到更多的锦鲤品种和分子标记，深入探究锦鲤整个品种群的进化历史，包括自然演化和人工选育对锦鲤遗传结构的影响，解析体色等观赏性状的遗传进化机制，为全面认识锦鲤的起源和演化提供更丰富的依据。