叶绿体基因组的遗传方式为单亲遗传，并具备一定程度的半自主性[1]。这些特征赋予叶绿体基因组在植物学研究领域，特别是植物多样性和系统发育研究中广泛的应用潜力[2]。此外，叶绿体基因组在植物适应性研究中也占有重要部分，通过分析其在不同环境条件下的变异和适应性进化，有助于揭示植物对环境变化的响应机制[3]。密码子作为遗传信息的基本单位，通过不同的编码方式对氨基酸进行编码[4]。由于遗传密码的简并性，同一氨基酸可由多种密码子编码，这些同义密码子在遗传信息的传递过程中发挥重要作用[5]。密码子使用偏好性是指不同物种或同一物种不同基因组区域在使用同义密码子时的选择倾向性，该偏好性的形成受多种因素影响，包括基因组背景、转录和翻译效率、密码子与反密码子配对的适应性等[6]。
1 材料与方法
1.1 数据来源
本研究所使用的黄檗叶绿体基因组数据（登录号：KY707335.1）从NCBI数据库中获得。该基因组的总长度为158 442 bp，包含88个编码序列（Coding DNA sequence，CDS）。在使用MEGA 6软件进行CDS筛选时，排除了重复序列以及长度不足300 bp的序列，最终筛选出52个CDS，用于后续分析。
1.2 分析方法
使用 Codon W 1.4.2 软件分析有效密码子数（Effective number of codons，ENC）、相对同义密码子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、密码子数量（N）以及8种氨基酸密码子第三位碱基腺嘌呤（A3）、胸腺嘧啶（T3）、胞嘧啶（C3）和鸟嘌呤（G3）的含量[9]。ENC值的高低可以推断密码子偏好性的强弱。ENC理论取值在20 ~ 61，越靠近20，密码子偏好性越强；越靠近61，密码子偏好性较弱，将45作为判断密码子偏好性强弱的标准。此外，利用CUSP软件评估密码子第一、第二和第三位的GC含量（GC1、GC2、GC3），以及基因组总体GC含量（GCall）；进一步采用SPSS 27.0软件分析密码子偏好参数的相关性。使用Excel软件用于绘制中性图表，分析影响密码子使用偏好性的因素。为揭示密码子使用偏好性的潜在影响因素，进行ENC-plot和PR2-plot分析。同时，选择RSCU值≥1的密码子作为高频密码子，计算高表达与低表达密码子的 ΔRSCU（两者之间的差值），通过设定ΔRSCU≥0.08的标准，筛选出高表达密码子，结合RSCU值≥1确定黄檗叶绿体基因组中的最优密码子[10]。
2 结果与分析
2.1 黄檗叶绿体基因组的密码子组成
经分析，黄檗叶绿体基因组中52个CDS密码子的GC平均含量为39.34%，密码子第一、第二和第三位的GC含量分别为47.63%、40.07%和30.32%。这些数据揭示出黄檗叶绿体基因组中的密码子的碱基在不同位置上对碱基A或尿嘧啶（U）存在偏好，而非均匀分布。此外，52个CDS的ENC值在37.79～61.00，平均值为49.13，ENC值>45的基因数有44个，表明黄檗叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。
表1 黄檗叶绿体基因密码子相关参数的相关性 |
| 参数 | GC1 | GC2 | GC3 | GCall | ENC |
|---|---|---|---|---|---|
| GC2 | 0.346* | ||||
| GC3 | 0.268 | 0.081 | |||
| GCall | 0.811** | 0.740** | 0.520** | ||
| ENC | 0.205 | -0.218 | 0.386** | 0.125 | |
| N | -0.124 | -0.267 | 0.195 | -0.143 | 0.151 |
|
RSCU分析结果显示，有30个密码子的RSCU值>1。以U为末端碱基的有16个，以A为末端碱基的有13个，仅有1个密码子以G作为末端碱基。表明黄檗叶绿体基因密码子在选择末端碱基时，更倾向A和U。
2.2 中性绘图分析结果
中性绘图分析结果显示，黄檗叶绿体基因组52个CDS的GC12值（GC1和GC2的平均值）在0.343 95～0.582 75，而GC3的值在0.209 1～0.369 8。GC12与GC3的相关性分析显示，二者的相关系数为0.214，未达到统计学显著性水平（P>0.05）（图1）。这一结果表明黄檗密码子的偏好主要受到选择压力的影响。
2.3 ENC-plot分析结果
2.4 PR2-plot分析结果
PR2-plot分析结果显示（图3），散点在各象限内分布不均，大多数分布在象限下方，表明具有显著偏好性的是密码子的第三位碱基，且4种碱基的使用频率差异显著。表明黄檗叶绿体基因组密码子使用偏好主要受自然选择的影响。
2.5 最优密码子确定
据RSCU分析结果，在黄檗叶绿体基因组中鉴定出33个高频密码子，这些密码子的RSCU值≥1。其中，29个密码子的ΔRSCU≥0.08，将这些密码子定义为高表达密码子。以ΔRSCU≥0.08且RSCU值≥1为标准，最终筛选出10个最优密码子，即UUU、CUU、CCC、ACA、UAU、CAU、AAU、UGA、AGA和GGA。
3 结论与讨论
本研究中，有30个密码子的RSCU值>1，其中以U为末端碱基的有16个，以A为终止碱基的有13个，以G为末端碱基的仅1个。这表明黄檗叶绿体基因组的密码子末位碱基偏好使用A或U。ENC值>45的基因有44个，表明黄檗叶绿体基因组密码子使用偏好性较弱。这一结果与荨麻和栽培型向日葵等植物叶绿体基因组的研究结果一致[16]，表明不同植物在叶绿体基因组的密码子使用偏好性上存在一定的共性，这与叶绿体基因组的进化和适应性有关。此外，黄檗叶绿体基因组中GC平均含量39.34%，且密码子第一、二位的GC含量高于第三位，这一特征与北沙参等双子叶植物的研究结果相似[17]，显示不同植物类别在密码子使用模式上存在一定的相似性，与基因组的结构和稳定性有关。黄檗叶绿体基因组中密码子的末位碱基偏好A或U，这一模式与某些单子叶植物的密码子使用模式类似，说明在不同植物中，密码子的末位碱基偏好受到相似的进化压力和选择机制的影响。然而，尽管存在这些共性，不同植物在密码子使用偏好性和基因组结构上仍表现出显著差异[18]。例如，黄檗叶绿体基因组的密码子使用偏好性较低，而某些植物的叶绿体基因组表现出更高的密码子使用偏好性和较低的ENC值。这种差异与植物的进化历史、环境适应性和基因组结构有关，需进一步试验验证和分析[19]。黄檗叶绿体基因组中GC平均含量39.34%，不同植物的叶绿体基因组中GC含量与基因组碱基组成存在差异，与其特定的生理和生态适应性有关。大多数植物表现出不同的末位碱基偏好，这种差异与植物的翻译效率、mRNA稳定性以及蛋白质合成机制有关，需深入研究探究[20]。
本研究分析了黄檗叶绿体基因组水平的密码子使用偏好，并揭示其在突变压力和自然选择影响下的特征。然而，该研究尚不全面，需在未来研究中进一步完善。目前尚未探讨特定基因表达水平和功能影响，以及特定基因的表达模式与其密码子偏好性之间的直接关系。未来研究可结合转录组数据，深入分析特定基因的表达模式及其与密码子使用偏好的关系，以更全面地理解密码子偏好性对基因功能的影响。此外，基因表达调控和环境因素在密码子使用偏好中的潜在影响尚未得到充分评估[19]，后续研究应纳入基因表达调控和环境因素，以更全面地评估其对黄檗叶绿体基因组密码子使用偏好的影响。通过多因素分析模型，探讨这些因素在密码子使用偏好中的交互作用和潜在机制，将有助于更全面地理解密码子使用偏好的形成和调控机制。还可以通过基因工程技术，将筛选的最优密码子应用于黄檗的遗传改良，通过试验验证其在提升基因表达效率和改良植物特性方面的实际效果。这不仅有助于提高黄檗的经济和药用价值，还可为其他药用植物的遗传改良提供参考。