凤梨释迦（Annona × atemoya）是番荔枝科番荔枝属植物，属热带亚热带多年生半落叶性小乔木植物[1]。该植物栽培适应性广，果肉柔滑，风味独特香甜，含有丰富的维生素C和多种营养成分，具有较高的经济价值，深受广大消费者的喜爱[2-3]。目前，凤梨释迦在海南、福建、广东、广西和云南等热带亚热带地区栽培面积逐年扩大，规模化、集约化种植格局初步形成[4]。随着种植规模的快速扩张，市场对优质凤梨释迦种苗的需求持续攀升，导致其种苗供应难以满足当前市场需求。武爱龙等[5]从生物学特性、种植技术、水肥管理、病虫害防治等方面总结了凤梨释迦的栽培管理技术。赖瑞云等[6]从大棚环境控制管理、树体构架培养、整形修剪、花果与肥水管理等方面阐述了凤梨释迦设施栽培技术，为该水果反季节生产提供参考。该植物种苗获得的方式主要是种子繁殖和嫁接繁殖。其喜温暖、不耐冷，果实结种数量不多，种子外壳坚硬，直接在土壤播种的发芽率不高、出苗差且不整齐；而通过嫁接方式生产该种苗，费时费工，生产成本高，难以实现规模化生产[7]。采用植物组培快繁技术可以避免以上繁育方式的弊端，有利于保持母株优良性状，种苗齐整，并实现凤梨释迦种苗的全天候标准化、工厂化生产[8]。关于凤梨释迦方面的组培快繁研究有待进一步深入。为此，本研究以凤梨释迦幼嫩带节茎段为外植体，分析不同激素配比的培养基对其愈伤组织的诱导率、分化率，不定芽的增殖倍数以及生根率的影响，为实现凤梨释迦种苗的工厂化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
选择生长良好、健康、无病虫害的凤梨释迦植株作为试验材料，其由湛江双双赢释迦种植基地提供。MS培养基配制成100 mg/L母液备用；6-苄氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蔗糖、琼脂均购于国药化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯，购于广州化学试剂厂。
1.2 试验设计
1.2.1 外植体消毒处理
以凤梨释迦的2 cm幼嫩带节茎段为外植体，用中性洗涤剂泡洗外植体材料10 min，在流水下冲洗30 min，晾晒10 min后，将其置于超净工作台中用75%乙醇浸泡处理30 s，其间不断晃动，再用无菌水冲洗3次，晾干备用。
1.2.2 愈伤组织的诱导培养
以MS培养基作为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L以及不同浓度的6-BA和2，4-D，设计了9组诱导培养基，命名为A1～A9（表1）。将2 cm幼嫩带节茎段作为外植体接种于诱导培养基上进行愈伤组织诱导，每处理20瓶，每瓶接种2个幼嫩带节茎段，重复3次。生长40 d后统计愈伤组织诱导率，以筛选最佳诱导培养基，诱导率计算如式（1） 。
愈伤组织诱导率（%）=形成愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100
表1 诱导培养基具体配方 |
| 处理 | 蔗糖/（g/L） | 琼脂/（g/L） | 6-BA/（mg/L） | 2，4-D/（mg/L） |
|---|---|---|---|---|
| A1 | 30 | 6 | 0.5 | 0.5 |
| A2 | 30 | 6 | 0.5 | 1.0 |
| A3 | 30 | 6 | 0.5 | 2.0 |
| A4 | 30 | 6 | 1.0 | 0.5 |
| A5 | 30 | 6 | 1.0 | 1.0 |
| A6 | 30 | 6 | 1.0 | 2.0 |
| A7 | 30 | 6 | 2.0 | 0.5 |
| A8 | 30 | 6 | 2.0 | 1.0 |
| A9 | 30 | 6 | 2.0 | 2.0 |
1.2.3 愈伤组织的分化培养
以MS培养基作为基本培养基，添加蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L以及不同浓度的6-BA和NAA，设计了6组分化培养基，命名为B1～B6（表2）。40 d后将形成的愈伤组织转接于分化培养基上诱导不定芽，每处理接种20瓶，每瓶接种2个愈伤组织，重复3次。培养30 d后统计愈伤组织分化率，计算如式（2） 。
愈伤组织分化率（%）=分化出芽的外植体数/接种的外植体数×100
表2 分化培养基具体配方 |
| 处理 | 蔗糖/（g/L） | 琼脂/（g/L） | 6-BA/（mg/L） | 2，4-D/（mg/L） |
|---|---|---|---|---|
| B1 | 30 | 6 | 1 | 0.1 |
| B2 | 30 | 6 | 1 | 0.2 |
| B3 | 30 | 6 | 1 | 0.5 |
| B4 | 30 | 6 | 2 | 0.1 |
| B5 | 30 | 6 | 2 | 0.2 |
| B6 | 30 | 6 | 2 | 0.5 |
1.2.4 不定芽的增殖培养
以MS培养基作为基本培养基，添加蔗糖20 g/L、琼脂6 g/L以及不同浓度6-BA与NAA，设计了6组增殖培养基，命名为C1～C6（表3）。将分化的不定芽切下，添加到增殖继代培养基上，每个处理接种20瓶，每瓶接种1颗不定芽，重复3次。生长30 d后调查不定芽的增殖倍数，其计算如式（3） 。
不定芽的增殖倍数=分化出的有效苗数/接种的不定芽数
表3 增殖培养基具体配方 |
| 处理 | 蔗糖/（g/L） | 琼脂/（g/L） | 6-BA/（mg/L） | NAA/（mg/L） |
|---|---|---|---|---|
| C1 | 20 | 6 | 1 | 0.1 |
| C2 | 20 | 6 | 1 | 0.2 |
| C3 | 20 | 6 | 1 | 0.5 |
| C4 | 20 | 6 | 2 | 0.1 |
| C5 | 20 | 6 | 2 | 0.2 |
| C6 | 20 | 6 | 2 | 0.5 |
1.2.5 生根培养
以1/2 MS作为基本培养基，添加蔗糖20 g/L、琼脂6 g/L以及不同浓度的IBA和NAA，设计了6组生根培养基，命名为D1～D6（表4）。共接种20瓶，每瓶接种2株，各处理共接种40株，重复3次。3周后统计生根率及单株平均根数，计算如式（4 ）～（5 ）。
生根率（%）=生根的外植体数/接种的外植体数×100
平均根数=总生根条数/生根的组培苗数
表4 生根培养基具体配方 |
| 处理 | 生根培养基 |
|---|---|
| D1 | 1/2 MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
| D2 | 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
| D3 | 1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
| D4 | 1/2 MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
| D5 | 1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
| D6 | 1/2 MS+IBA 2.0 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L |
1.2.6 炼苗移栽
将凤梨释迦生根苗根系上的培养基洗净，种植在含蛭石、珍珠岩、草炭等基质的营养杯或穴盘中进行炼苗。炼苗室无阳光直射，散射光光照强度在5 000～6 000 lx，温度在20～28 ℃，基质湿度最初控制在80%～90%，在生根苗发出新根与新叶后，逐渐降低基质湿度。培养瓶苗15～20 d后移栽，统计移栽成活率及生长情况。
1.3 数据分析
采用 Microsoft Excel 2007软件进行试验数据处理分析，采用直观分析法设计正交试验，利用SPSS 22.0软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导效果
2，4-D能够促进愈伤组织的生长，提高植物组织细胞分裂能力；适宜浓度的6-BA对愈伤组织的诱导率、生长量都有明显的促进作用。将凤梨释迦幼嫩带节茎段接种于不同浓度6-BA与2，4-D的愈伤组织诱导培养基上进行培养，7 d后发现外植体切口处明显膨大、变厚；10 d后切口边缘产生致密的白色愈伤组织；25 d左右达到愈伤组织的生长高峰期，其颜色逐渐转绿。由表5可知，在A3诱导培养基（MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L）上愈伤组织的诱导率最高，达62.50%。
表5 不同诱导培养基对凤梨释迦愈伤组织诱导的影响 |
| 处理 | 接种的外植体数/个 | 诱导出愈伤组织的外植体数/个 | 愈伤组织诱导率/% |
|---|---|---|---|
| A1 | 40 | 19 | 47.50 |
| A2 | 40 | 12 | 30.00 |
| A3 | 40 | 25 | 62.50 |
| A4 | 40 | 20 | 50.00 |
| A5 | 40 | 17 | 42.50 |
| A6 | 40 | 16 | 40.00 |
| A7 | 40 | 22 | 55.00 |
| A8 | 40 | 21 | 52.50 |
| A9 | 40 | 10 | 25.00 |
2.2 愈伤组织的分化效果
由表6可知，B5分化培养基（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L）的愈伤组织分化率达65.00％，高于其他配比的分化培养基。在凤梨释迦愈伤组织分化过程中，随着培养基内激素浓度的升高，分化出的不定芽会出现玻璃化现象，且后期继代增殖生长缓慢。
表6 不同分化培养基对凤梨释迦愈伤组织分化的影响 |
| 处理 | 接种的外植体数/个 | 分化的愈伤组织数/个 | 愈伤组织分化率/% |
|---|---|---|---|
| B1 | 40 | 18 | 45.00 |
| B2 | 40 | 14 | 35.00 |
| B3 | 40 | 23 | 57.50 |
| B4 | 40 | 21 | 52.50 |
| B5 | 40 | 26 | 65.00 |
| B6 | 40 | 25 | 62.50 |
2.3 不定芽的增殖效果
由表7可知，在C2增殖培养基（MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L）中培养40 d后不定芽增殖倍数最高，为4.2，且形成的芽较粗壮，适合生根移栽。
表7 不同增殖培养基对凤梨释迦不定芽增殖的影响 |
| 处理 | 接种芽块数/个 | 增殖芽总数/个 | 增殖倍数 |
|---|---|---|---|
| C1 | 20 | 62 | 3.1 |
| C2 | 20 | 84 | 4.2 |
| C3 | 20 | 66 | 3.3 |
| C4 | 20 | 70 | 3.5 |
| C5 | 20 | 74 | 3.7 |
| C6 | 20 | 64 | 3.2 |
2.4 生根培养效果
将获得的凤梨释迦增殖苗转入生根培养基培养7 d后，部分处理形成小须根，连续培养3周后，统计生根率及根生长情况。由表8可知，生根培养基D2（1/2 MS+NAA 0.2 mg/L+蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L）培养凤梨释迦的生根率最高，达83.75%，长势旺，生长健壮。
表8 不同生根培养基对凤梨释迦生根培养的影响 |
| 处理 | 接种数/株 | 生根数/株 | 生根率/% | 单株平均根数/条 |
|---|---|---|---|---|
| D1 | 40 | 21.55 | 53.88 | 2.4 |
| D2 | 40 | 33.50 | 83.75 | 5.1 |
| D3 | 40 | 25.60 | 64.00 | 4.0 |
| D4 | 40 | 20.65 | 51.63 | 2.8 |
| D5 | 40 | 20.60 | 51.50 | 4.1 |
| D6 | 40 | 24.10 | 60.25 | 3.0 |
2.5 组培苗移栽成活率
将生根培养40 d后的组培苗，移至温室中不开盖炼苗7 d，然后拧松瓶盖培养2 d，再完全打开瓶盖培养3 d，最后将组培苗从培养瓶移出，小心洗净根部的琼脂，同时用多菌灵或高锰酸钾溶液浸泡消毒2 min，随后移栽至经消毒处理的营养杯或穴盘中，覆盖薄膜保温保湿，并用遮阴网遮阴。20 d后，揭开薄膜进行常规水肥管理，30 d后调查组培苗存活率。调查结果显示，其成活率在90%以上。
3 结论与讨论
植物组织培养技术在林木优良品种培育及良种快速繁殖的科研与生产实践中具有重要的应用价值。该技术可显著缩短林木良种生产周期，加速优良遗传性状推广，大幅提升繁殖系数，实现林木良种规模化、低成本供应[9-10]。随着组织培养技术的不断发展，其在热带植物快繁领域的应用逐步拓展，已有多种热带植物成功构建了组培快繁体系。例如，李志瑛等[11]针对槟榔树构建了稳定的组培快繁体系，在愈伤诱导阶段，培养基中2，4-D为120 mg/L时，其茎尖、合子胚、幼根愈伤诱导率均最高；在体胚诱导阶段，6-BA为50 mg/L时，体胚萌发率最高；在再生芽萌发及生根阶段，NAA为1 mg/L时，体胚萌发率和成苗率最高；王景飞等[12]建立了热带观赏植物富贵竹的规模化繁育组培快繁技术体系，其最佳增殖培养基为MS+6-BA 3.5 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最佳生根培养基为1/2 MS+NAA 0.5 mg/L。激素的种类与浓度对植物组织培养效果具有较大影响。合理筛选激素种类与浓度，可大幅减少试验次数，节省成本，同时提升试验结果的准确率。
本研究建立了凤梨释迦的组培快繁技术体系：以幼嫩带节茎段为外植体，MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L为愈伤组织最佳诱导培养基，诱导率达62.50%；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L为不定芽最佳分化培养基，分化率达65.00%；MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6 g/L为不定芽最佳增殖培养基，增殖系数为4.2；1/2 MS+NAA 0.2 mg/L +蔗糖20 g/L+琼脂6 g/L是最佳生根培养基，生根率达83.75%；移栽成活率在90%以上。相关结果为实现工厂化生产凤梨释迦种苗提供参考。