竹荪（Dictyophora indusiata）属于担子菌亚门鬼笔科竹荪属菌类，是营养价值较高的食药兼用菌[1-2]。大量研究发现，竹荪具有抗炎、抗氧化[3]、抑菌[4]和降血脂[5]等多种保健功效。竹荪除食用和药用外，还具有一定的防腐功效[4]。在制作菜品时，置入少许竹荪，可在一定程度上延长存放时间。食品防腐是保障食品安全的重要手段，目前使用的防腐剂以化学合成防腐剂为主，如苯甲酸及其钠盐等。随着人们生活水平的不断提高，天然生物防腐剂备受关注，开发和研究新型的抗菌性强、安全性能高以及使用方便的天然生物防腐剂具有重要的现实意义。竹荪具有较强的抑菌作用，王博阳等[6]与张永杰等[7]利用乙酸乙酯对竹荪进行提取，发现其分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌及层出镰刀霉菌具有很好的抑制效果。刘范等[8]研究发现，竹荪菌盖提取物可有效抑制FocTR4的生长，具有用于香蕉枯萎病防治的潜质。刘萌萌等[9]采用Meta分析评价竹荪提取物对5种微生物的抗感染效果，发现竹荪提取物对革兰阴性菌的抑制效果较好。竹荪作为食品防腐剂的研究尚处于探索阶段，鉴于竹荪的防腐效果，本试验分别采用乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚和蒸馏水4种溶剂来浸提竹荪子实体，研究不同浸提液分别对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用，并用肉汤、馒头对浸提液实际防腐效果进行验证，为进一步开展竹荪防腐研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料
竹荪干品、馒头购自当地超市。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霉菌和酵母菌均由信阳农林学院生物与制药工程学院微生物实验室提供。
1.1.2 培养基和溶剂
（1）培养基。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂粉20 g，加水定容至1 000 mL。马铃薯琼脂培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉25 g，加水定容至1 000 mL。麦芽汁培养基：麦芽汁150 mL，琼脂粉3 g。（2）溶剂。乙酸乙酯、石油醚和无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。
1.1.3 主要仪器
循环水式多用真空泵（SHB-ⅢS，郑州长城科工贸有限公司），电热恒温水浴锅（HH-6型，北京中兴伟业仪器有限公司），立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40Ⅰ型，上海申安医疗器械厂），双人双面净化工作台（SW-CJ-2F型，苏州净化设备有限公司），高速万能粉碎机（FW400A型，北京中兴伟业仪器有限公司），旋转蒸发器（R-201型，上海雅荣生化设备仪器有限公司），恒温振荡器（THZ-82A，国华企业集团有限公司），电热恒温培养箱（JC303型，上海成顺仪器仪表有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 竹荪样品前处理
将竹荪干品放入粉碎机中进行粉碎，过80目筛，备用。
1.2.2 浸提溶剂选取
表1 浸提溶剂物理特性 |
| 溶剂名称 | 极性 | 黏度/（Pa·S） | 沸点/℃ |
|---|---|---|---|
| 石油醚 | 0.01 | 0.30 | 30～60 |
| 乙酸乙酯 | 4.30 | 0.45 | 77 |
| 无水乙醇 | 78.15 | ||
| 蒸馏水 | 100 |
1.2.3 竹荪浸提液制备
（1）水浴浸提。乙酸乙酯浸提：称取25 g竹荪粉末，置于500 mL烧杯中，加入375 mL乙酸乙酯，用玻璃棒搅拌均匀并封口，于72 ℃水浴锅中水浴5 h，水浴过程中用玻璃棒搅拌，结束后于真空泵中进行抽滤，弃滤渣得到浸提滤液。无水乙醇浸提方法同乙酸乙酯浸提方法。石油醚浸提（22 ℃水浴锅中水浴5 h）和蒸馏水浸提（80 ℃水浴锅中水浴5 h），除浸提溶剂和水浴温度外，同乙酸乙酯浸提方法。（2）旋转蒸发浓缩。将过滤后得到的滤液分别于旋转蒸发仪中进行蒸发，将滤液浓缩至5 mL左右，并于玻璃瓶中密封，置于冰箱中0～4 ℃保存，防止液体挥发。4种浸提液分别标记为1号（乙酸乙酯浸提）、2号（无水乙醇浸提）、3号（蒸馏水浸提）和4号（石油醚浸提）。
1.2.4 微生物抑菌试验
（1）供试菌株悬浮液的制备。细菌类悬浮液的制备：分别挑取一菌环斜面试管供试菌，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，置于37 ℃摇床中培养24 h。
霉菌、酵母菌悬浮液的制备：从斜面挑取一菌环霉菌、酵母菌，分别接种于马铃薯琼脂培养基和麦芽汁培养基中，置于28 ℃，80 r/min恒温摇床中培养48 h。
（2）抑菌试验方法。将活化培养的大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌分别稀释10倍，再吸取稀释10倍的菌液0.1 mL于培养皿中，用涂布棒涂抹，使菌液均匀分布。取若干个灭菌滤纸，将其置于菌液表面，用移液器吸取0.1 mL不同浸提液，依次滴在不同滤纸片上。然后将测试细菌（大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）的培养皿置于37 ℃培养箱中，培养24 h；将测试霉菌、酵母菌的培养皿置于28 ℃培养箱中，培养4 d。培养结束后测量抑菌圈直径。
1.2.5 不同稀释度抑菌试验
取抑菌效果最优的浸提液，分别对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌进行稀释度抑菌试验，稀释度分别为1倍、2倍、4倍和8倍。抑菌试验方法同上。
1.2.6 食物抑菌防腐验证
为了验证竹荪浸提液的抑菌防腐效果，以肉汤和馒头作为材料。基于抑菌试验结果，舍去4号竹荪浸提液。（1）肉汤防腐。选取一定量肥瘦相间的猪肉，煮至有肉香味溢出后将肉汤分为4份，每份50 mL，在其中3份肉汤中分别加入0.5 mL 1、2和3号浸提液，另外一份加入等量的无菌水，再煮30 s左右，密封容器，置于37 ℃电热恒温培养箱内培养，每隔一段时间观察肉汤的状态，确定腐败时间及不同浸提液的抑菌效果。
（2）馒头防腐。将1、2和3号浸提液分别稀释20倍后置于喷壶中备用。各取馒头1个（选取同一批次）于培养皿上，用等量浸提液分别喷洒整个馒头，以喷洒等量无菌水的馒头作为对照，封口膜包裹密封后置于28 ℃电热恒温培养箱内培养，在高温高湿环境中人为促变，每隔一段时间观察一次馒头的状态，并记录。
1.3 数据分析
试验数据采用Excel软件进行处理与分析。
2 结果与分析
2.1 不同浸提液对不同微生物的抑菌效果
从表2可以看出，不同溶剂浸提液对不同微生物的抑菌效果存在差异。其中，1号浸提液的抑菌效果较佳，抑菌效果由强到弱为霉菌>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌>酵母菌、沙门氏菌，对霉菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径1.8 cm；2号浸提液的抑菌效果由强到弱为沙门氏菌>霉菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母菌，对沙门氏菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达2.1 cm；3号浸提液的抑菌效果由强到弱为大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>沙门氏菌>酵母菌、霉菌，对大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径1.3 cm；4号浸提液的抑菌效果由强到弱为酵母菌>沙门氏菌>金黄色葡萄球菌>霉菌>大肠杆菌，对酵母菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径0.9 cm；4种浸提液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌均有明显抑菌作用，而4号浸提液对大肠杆菌和霉菌均无明显抑制作用。依据抑菌圈直径大小，不同浸提液的抑菌强度排序为1号>2号>3号>4号。
表2 不同浸提液对不同微生物的抑菌圈直径 (cm) |
| 菌种名称 | 竹荪浸提液 | 抑菌圈直径 |
|---|---|---|
| 大肠杆菌 | 1 | 1.5 |
| 2 | 1.4 | |
| 3 | 1.3 | |
| 4 | 0.5 | |
| 金黄色葡萄球菌 | 1 | 1.6 |
| 2 | 1.3 | |
| 3 | 1.2 | |
| 4 | 0.7 | |
| 沙门氏菌 | 1 | 1.2 |
| 2 | 2.1 | |
| 3 | 1.1 | |
| 4 | 0.8 | |
| 霉菌 | 1 | 1.8 |
| 2 | 1.5 | |
| 3 | 1.0 | |
| 4 | 0.6 | |
| 酵母菌 | 1 | 1.2 |
| 2 | 1.1 | |
| 3 | 1.0 | |
| 4 | 0.9 |
2.2 不同稀释度的1号浸提液对不同微生物的抑菌效果
选取抑菌效果最明显的乙酸乙酯浸提液做进一步稀释度抑菌试验。从表3可看出，1号浸提液稀释2倍时对沙门氏菌、霉菌和酵母菌的抑菌效果无差异；稀释4倍时对大肠杆菌基本无抑菌作用（抑菌圈直径小于0.5 cm）；稀释8倍时对金黄色葡萄球菌有抑菌作用，而对其他4种菌种基本无抑菌效果。
表3 不同稀释度的1号浸提液对不同微生物的抑菌效果 (cm) |
| 菌种名称 | 1倍 | 2倍 | 4倍 | 8倍 |
|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 | 1.5 | 1.3 | 0.5 | 0.5 |
| 金黄色葡萄球菌 | 2.0 | 1.5 | 1.3 | 1.2 |
| 沙门氏菌 | 2.1 | 1.4 | 1.3 | 0.5 |
| 霉菌 | 2.2 | 1.4 | 1.1 | 0.6 |
| 酵母菌 | 2.1 | 1.4 | 1.3 | 0.5 |
2.3 不同浸提液对食物的抑菌防腐效果
2.3.1 对肉汤的防腐效果
24 h后加无菌水的肉汤有轻微异味，其他均良好；40 h后除加1号浸提液的肉汤外观良好外，其他均变质；4 d后添加1号浸提液的肉汤发生变质。肉汤变质先后顺序为加无菌水肉汤、加3号浸提液肉汤、加2号浸提液肉汤、加1号浸提液肉汤；添加1号浸提液的肉汤保存时间最长，为4 d，且肉汤在保存8 h后仍有浓郁香味，说明竹荪浸提液可在一定程度上保持肉汤风味、防止变质。
2.3.2 对馒头的防腐效果
保存48 h后，喷洒1、2和3号浸提液及无菌水的馒头均开始变质，变质先后顺序为喷洒无菌水、3号浸提液、2号浸提液、1号浸提液，且馒头表面的菌种类和状态不同；保存3 d后，喷洒无菌水的馒头菌种类最多且分布最广，异味最重，除了分布有白色菌丝，还有黄色的霉点，菌丝上面有黑色或白色的孢子；喷洒1号浸提液的馒头表面有少量菌丝，较其他处理的菌丝短，无明显异味；喷洒2号浸提液的馒头表面有少许白色菌丝和黄色的霉点；喷洒3号浸提液的馒头表面有绿色、灰褐色霉点，且霉点分布较广。由此得出，对馒头的抑菌效果强弱为1号>2号>3号>无菌水，说明竹荪浸提液对馒头有一定的防腐作用，其中1号浸提液的抑菌作用最强。
3 结论与讨论
本研究采用乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚和蒸馏水4种溶剂浸提竹荪子实体，验证了不同浸提液对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用。结果表明，4种不同溶剂浸提的竹荪浸提液均有不同程度的抑菌效果，其中乙酸乙酯浸提液的抑菌效果最好，无水乙醇、蒸馏水浸提液的次之，石油醚浸提液的效果最差；乙酸乙酯浸提液的稀释度抑菌试验表明，其稀释4倍后仍具有抑菌作用；4种浸提液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌均有明显抑菌作用；馒头和肉汤防腐试验表明，竹荪乙酸乙酯浸提液对两者的抑菌防腐效果较好，即验证了竹荪具有一定的防腐效果，尤其是在肉类防腐方面。综上，竹荪具有较好的抑菌防腐作用，具有一定开发天然食品防腐剂的潜力，相关研究有待进一步深入。