水草相较于陆地植物，根系欠发达，整体偏弱，组培难度较高，且培养基更容易出现污染菌，其中小水榕（Anubias barteri）[1]、雪花草（Hottonia inflata）[2]和小对叶（Rotala rotundifolia）[3]等均已见相关报道。已有报道主要倾向在陆生植物组培中发现污染菌，如细菌和真菌，其中细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）[4]，真菌主要有芽枝霉属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillum）和酵母属（Saccharomyces）[5]。目前关于水草组培过程中污染菌的种类暂不明确。在水草组织培养过程中，培养基的污染问题一直是该领域的技术盲区，大量组培苗因培养基前期被污染而使得种苗的繁殖受到影响。对于观赏价值高、难以培养的名贵品种，其易在形成愈伤组织过程中受到不同菌类的污染，使组织培养难以继续进行。
水草组织细胞培养是水族科学与技术专业的一门拓展课程，主要对水草组织培养的基本原理、方法及应用进行介绍，让学生掌握培养基的制备、外植体的接种、无菌培养及移栽等组织培养技术相关基础操作。培养基中出现污染菌是导致水草组织培养失败的主要原因之一，但有关污染菌的研究报道较少。
在组培过程中，微生物污染防治一直备受关注。本文对水草组培污染防治课程的实验教学进行设计，以红丝青叶（Hygrophila polysperma）为研究对象，对其组培过程中出现的典型污染菌进行分离、纯化和种类鉴定，并明确其各菌种的系统进化关系，同时筛选相关防治药物，优化培养基，以有效控制组培过程中的污染，使水草组培过程得以顺利进行，成功培育出水草组培苗。
1 水草组培污染防治课程实验训练教学设计
1.1 教学目标
以解决水草组培过程中存在的污染为目标，运用理论课堂上学习的水草组培培养基制备，污染菌分离、鉴定，药敏检测及数据分析等知识，熟练掌握水草组培污染菌分离、鉴定及药物敏感性检测的基本原理和操作步骤，巩固该课程的理论基础，直观展示各种菌的分离及表型鉴定技巧，使学生更加了解污染源的种类与防治措施，加强对防治作用机理的理解，培养学生的综合能力和科研探索精神。
1.2 教学内容
在实验教学过程中，详细介绍组培污染源的分离、鉴定及药物筛选的常规技术方法，以及其在组培培养基优化中的应用，并讲解药物防治的实验原理和相关注意事项。从方案的制订到实验条件的摸索尝试，从实验规程的讲解到实践操作，从理论知识复习到实验数据的处理，让学生参与实验的全过程，结合理论知识与实验操作，实现理论联系实际。
2 实验内容及流程分析
2.1 实验材料
红丝青叶、MS（Murashige and skoog）培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextrose agar，PDA）、微生物培养基（Luria-bertani，LB）和大豆肉汤（Tryticase soy broth，TSB）琼脂平板、75%乙醇、2%次氯酸钠溶液、蔗糖、6-KT、IBA、乳酚棉蓝（Lactophenol cotton blue，LPCB）溶液、FastPure®细菌DNA提取试剂盒（Vazyme，南京）、真菌DNA分离试剂盒（Solarbio，北京）、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、PCR反应液、50 μg/mL卡那霉素（Kanamycin，Kan）、100 μg/mL氨苄西林（Ampicillin，Amp）、250 μg/mL红霉素（Erythromycin，Ery）、200 μg/mL壮观霉素（Spectinomycin，Spc）或25 μg/mL氯霉素（Chloramphenicol，Chl）、山梨酸钾（Potassium sorbate，PS）、苯甲酸钠（Sodium benzoate，SB）或双乙酸钠(Sodium diacetate，SD）溶液以及纳米银（Nanoscale silver，nano-Ag）。
2.2 实验原理
抗生素可以通过以下几种途径抑制或杀灭细菌。一是影响细菌细胞壁的合成；二是改变细菌细胞膜的通透性；三是影响细菌细胞的蛋白质合成；四是抑制细菌核酸的合成。防腐剂通过抑制霉菌的生长繁殖，来抑制微生物体内的脱氢酶系统，达到抑制微生物的生长和防腐作用，对霉菌、酵母菌等均具有较好的抑制作用。
2.3 实验教学流程
2.3.1 讲解注意事项
介绍水草组培污染菌分离、鉴定及药物筛选实验设备组成、试验操作过程，讲解方案设计注意事项。
2.3.2 演示实验
植物材料和培养条件：红丝青叶购自山东当地水生植物农场，长5～6 cm，含5～6个节点，先用自来水冲洗叶片5 min。在超净工作台上，把枝段切成长4～5 cm的小段，每小段包含2～3个节点，用75%乙醇进行表面消毒0.5 min，并迅速转移到2%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，然后用无菌蒸馏水连续搅拌冲洗3次。将消毒后的外植体切成长0.5～1.0 cm的小段，在含有MS培养基的240 mL培养容器（6 cm×9 cm）中培养数周。MS培养基添加3%蔗糖，1.0 mg/L 6-KT和1.0 mg/L IBA，用0.65%琼脂固化，在高压灭菌(118 kPa大气压）前pH调至5.8±0.1。每个培养容器包含2～4个茎的外植体。所有培养物在（26±1）℃和60%～70%湿度下培养，在16 h光周期（5 000 lx）下使用气候室内的白色荧光灯（宁波）。
（1）细菌的分离与鉴定。根据表型观察，细菌污染物通常在30 d内长于MS培养基中。将分离的细菌划线接种于常见的LB和TSB琼脂平板上，分别在26 ℃下孵育48 h。选择单个菌落，重新划线。当所有菌落在琼脂平板上的形态相同，并获得细菌分离物的纯培养时，所有分离物菌液加入15%甘油保存在-80 ℃冰箱中。
（2）真菌的分离与鉴定。MS培养基中也出现了数种真菌，依据其表型，选择典型真菌接种于PDA板上，于26 ℃培养箱培养72 h，多次接种后得到真菌纯培养物，在4 ℃环境下保存于PDA板上备用。用LPCB溶液染色真菌，用透明纸胶带法检测真菌形态[6]。将一根含有真菌样本的玻璃纸胶带压在玻璃载玻片表面，另一根玻璃纸胶带粘贴在玻璃载玻片的非磨砂端。在胶带的交叉处滴一滴LPCB。几分钟后，LPCB渗透到真菌体内，利用显微镜观察真菌形态并拍照。
（3）细菌的分子鉴定与系统发育树的构建。用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤细菌细胞2次，使用FastPure®细菌DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR反应的模板。采用通用引物27F（正义引物，5’-AGAGTTGATCATGGCTCA-3’）和1492R（反义引物，5’-GGTTCACTTGTTACGTT-3’）对所有分离株进行PCR扩增16S rDNA基因，如参考文献[7]所述。扩增在热循环器（BioRad，USA）中进行，循环程序：95 ℃变性5 min，然后执行94 ℃ 0.5 min、55 ℃ 0.5 min和72 ℃ 1 min连续循环34次，最后72 ℃延长7 min。PCR产物在1%三乙酸-EDTA缓冲液中1.2%（w/v）琼脂糖凝胶（含GelRed）电泳分析。在紫外线照射下观察凝胶并拍照。PCR产物送至生物技术公司进行Sanger测序。将16S rDNA序列提交至NCBI GenBank数据库，使用BLASTn算法进行比对。鉴定出一种细菌的16S rDNA序列的核苷酸同源性在97%以上。利用Mega 6.0中CLUSTALX程序生成的多序列比对，采用邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育树[8]。遗传距离矩阵采用Kimura的双参数模型（Kimura’s two-parameter model）[9]得到1 000个重复的 Bootstrap值，以百分比显示。
（4）真菌的分子鉴定。采集菌丝并用无菌玻璃球研磨，用真菌DNA分离试剂盒提取真菌基因组DNA。以DNA为模板进行PCR反应，使用ITS-F（上游引物，5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS-R（下游引物，5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）扩增真菌核糖体基因的内部转录间隔区（ITS）序列[10]，随后采用上述类似程序进行真菌的分子鉴定。
（5）细菌抑制药剂筛选试验。细菌在26 ℃ LB中培养24 h。在26 ℃ LB和琼脂中分别添加50 μg/mL卡那霉素（Kan）、100 μg/mL氨苄西林（Amp）、250 μg/mL红霉素（Ery）、200 μg/mL壮观霉素（Spc）或25 μg/mL氯霉素（Chl），观察细菌生长情况。检查抗生素耐受水平，并记录为敏感（-）或耐药（+）。
（6）真菌抑制药剂筛选试验。于26 ℃条件下，在分别添加0.015 625%（w/v）、0.031 250%（w/v）、0.062 500%（w/v）、0.100 000%（w/v）、0.125 000%（w/v）、0.250 000%（w/v）、0.500 000%（w/v）和1.000 000%（w/v）山梨酸钾的PDA琼脂板上观察真菌生长14 d。同样，测试一系列浓度的苯甲酸钠或双乙酸钠溶液以及纳米银对真菌的抑制作用。
（7）抗菌剂对外植体的影响。测试抗菌药物对外植体生长的影响。一方面，加入50 µg/mL Kan和25 µg/mL Chl（Kan+Chl）、1/2（Kan+Chl）、1/5（Kan+Chl）和1/10（Kan+Chl），观察细菌抑制作用效果，观察外植体生长情况14 d。另一方面，研究PS、SB和SD（0.015 625%、25%、0.0625%、0.061%、0.2%和0.5%）对真菌的抑制作用和对外植体生长的影响，并测定适当的抗菌药物浓度。将外植体或幼苗放置在添加上述适当浓度药物的MS培养基中生长。
（8）移栽。将幼苗移植到水族馆土壤中，记录其60 d生长情况并拍照。
2.3.3 实验后续处理
（1）对学生进行分组，每组学生挑选细菌或真菌试样并进行方案设计，培养学生自主动手能力。（2）检验每组实验情况，并适当抛出问题，引发学生思考，调动学习积极性。（3）课程结束后，继续进行后续实验及数据分析。（4）留取作业，并形成实验报告。
3 水草组培污染防治实验教学效果分析
采用水草组织细胞培养课程与水草组培污染防治实验相结合的教学模式，提高水族科学与技术专业人才培养质量；通过组培教学平台，有效提升学生的综合实践能力。
首先，培养基配制与优化是水族科学与技术专业类学生参与水草组培的必备基础，其有利于引导学生更好地理解组培操作原理与过程，让学生了解水草组培污染防治对水草组培的意义，拓展水草组培培养基优化的配方分析，引导学生思考防治培养基污染实验的基本原理；培养学生研究水草组培污染防治实验的整体思维，提高科研能力。其次，水草组培污染防治实验需要通过团队协作有序展开，实验课程大多采用分组方式进行教学。将学生分成5～6组，分阶段接替完成，以确保每名学生均能动手实践，培养协作能力，提高自主学习性。再次，教师详细讲解组培理论、防治机理和培养基优化分析等知识，结合实验测试原理，对所收集的数据进行分析，帮助学生直观了解组培、污染源检测和抑菌机制等概念，强化学生对理论知识的理解，使其在实验课程学习过程中实现对理论知识的融会贯通，并在实验中灵活运用。最后，结合水草组培污染防治实验，学生实际参与方案设计、培养基制备、污染菌鉴定、药物筛选防治和数据分析等全实验流程，提高了其实践操作能力，有利于其更加深刻地理解并掌握水草组培培养基优化知识。
4 结语
Lewis等[11]研究认为，水生植物生长在淡水和盐水中具有不同的生命周期和结构。水生植物可以通过营养方式快速繁殖，其中，组织培养是生产中的重要应用手段之一。植物材料通过70%～75%乙醇、2%次氯酸钠或0.1%氯化汞进行表面消毒，而这些消毒剂可能对植物细胞产生不利影响，需要控制合理的使用剂量与处理时间。在此情况下，某些类型的微生物，如假单胞菌、农杆菌和克雷伯氏菌，可能不会被破坏；内生菌可能免受表面消毒处理。为消除培养基中不必要的微生物，Li等[12]测试了几种药物，以确定适当的抑菌浓度，即10 µg/mL Kan、5 µg/mL Chl和0.015 625% PS的混合物，可抑制微生物感染，且可避免对外植体脱分化和再分化的负面影响，并应用于MS培养基的优化改良。为使学生更好地理解水草组培污染防治的原理，以污染防治实验为出发点开展组培污染防治教学非常必要。通过污染源的菌种鉴定分析、筛选防治药物及优化培养基的探索研究，锻炼学生的实践能力、理论应用能力及科研探索能力，提高其对科研的兴趣，为从事水草扩繁生产和相关科学研究奠定基础。在教学过程中，学生能够更直观地学习组培培养基配制、细菌分离与鉴定和药敏反应等知识，有利于调动学生的学习积极性，提升实验参与性，培养理论和实践应用的整体思维等，为水族专业学科水草组织细胞课程教学改革提供新视角和参考。