据统计，目前新疆地区水稻总种植面积约8×104 hm2，产量高达7×104 t[1]。水稻生产中常会发生病虫危害，如在石河子大学农学院试验田出现稻穗颖壳褐色或浅褐色症状，少数形成发白的稻穗空壳，影响稻穗的外观、产量及品质。用刀片刮取颖壳表面的褐色斑于显微镜下镜检，发现是链格孢属（Alternaria sp.）真菌分生孢子。
链格孢属95%以上的种类兼性寄生于植物上，可造成田间和产后损失，包括黑斑、果腐等在内的多种经济作物病害。例如，邵雪花等[2]报道链格孢菌（A. alternata）可引起橄榄黑斑病；马文娟等[3]报道A. alternata可引起西番莲果腐病；李雅楠等[4]报道A. alternata可引起马铃薯黑点病；此外该病原菌还会产生链格孢霉毒素，给食品安全带来隐患，如关文碧等[5]报道，被链格孢属真菌侵染的食品中会产生细胞毒素、生殖和发育毒素，威胁食品安全和人类健康。目前，有关水稻褐变穗的研究报道较多，该病害的病原具有多样性的特点。例如，黄世文等[6]鉴定出水稻穗腐病的病原为细交链孢菌（Alternaria tenuis）、层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、澳大利亚平脐蠕孢菌（Bipolaris australiensis）和新月弯孢菌（Curvularia lunata）；费丹等[7]研究表明，水稻穗腐病的病原为新月弯孢菌（Cartularies lunatics）、细交链格孢菌、层出镰刀菌和稻黑孢菌（Nigrospora oryzae）；胡颂平等[8]研究表明，水稻穗腐病的病原为稻黑孢菌、细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、厚垣镰刀菌（Fusarium chlamydosporum）和香茅弯孢菌（Curvularia cymbopogonis）；张俊华等[9]研究表明，链格孢菌为水稻穗腐病的主要病原菌；马盾等[10]研究表明，细交链孢菌、新月弯孢菌和层出镰刀菌为水稻穗腐病的病原菌。已有研究结果表明，水稻穗部病害是由多种真菌侵染引起的。为探究石河子大学农学院试验基地内水稻褐变病穗的病原，本研究对该试验基地水稻病穗进行分离和纯化，通过形态学、分子生物学和致病性测定进行病原菌物种鉴定，并研究了其生物学特性，为该病害田间防治及管理提供参考。
1 材料与方法
1.1 病样的采集、分离、纯化及代表性菌株的选择
参考《植病研究方法》[11]中5点取样法，采集石河子大学试验田中具有典型病症的稻穗，通过组织分离法对病穗进行病原菌分离。将采集的病穗置于尼龙纱制成的网袋内，自来水冲洗2 h，用无菌手术刀剥离发病谷壳，切取病健交界处组织，用75%乙醇浸泡10 s，之后用无菌水冲洗3次，处理后的病组织置于无菌吸水纸上，于超净工作台晾干，然后置于添加链霉素的PDA平板培养基上，每皿等边三角形接入3块病组织，于28 ℃恒温培养箱中培养。
单孢分离参照Luo等[12]的方法进行。病组织周围长出菌丝后，挑针取边缘菌丝块转入新鲜PDA培养基（直径90 mm），28 ℃恒温培养7 d，观察菌落形态特征是否一致。移液器吸取0.1 mL分离株孢子悬浮液（300～500个孢子/mL），注入新鲜PDA培养基表面，用涂布器均匀涂开，待孢子萌发形成单孢菌落，挑选长势旺、萌发快的菌落转入PDA培养基培养7 d，依据菌落形态、颜色及分生孢子特点选取代表性菌株进行鉴定。
1.2 致病性测定
水稻种子编号：T43，由石河子大学农学院提供，水稻清水催芽后，均匀种植于营养钵内（直径30 cm，高40 cm），待水稻生长至抽穗期时备用。
接种方法采用喷雾方式，分生孢子悬浮液浓度为1×106 cfu/mL。用50 mL喷壶将孢子悬浮液均匀喷洒在抽穗期健康水稻穗部，用白色保鲜袋保湿24～48 h，以喷洒无菌水作为对照。分别于接种后2、4、6和8 d观察并记录其发病情况及症状，根据柯赫氏法则，同时对发病病穗再次进行病原分离，观察分离得到的菌株生物学形态是否与接种菌株相同。
1.3 病原菌鉴定
1.3.1 形态学鉴定
采用盖玻片斜插培养法：在PDA培养基表面正三角斜插灭菌盖玻片，将病原菌接种至盖玻片周围，28 ℃恒温培养7 d，然后用带测量标尺的数码显微镜查看分生孢子梗、分生孢子的着生状态，以及分生孢子大小和纵、横隔数，并测量30个分生孢子及其喙的大小，根据链格孢属种的特征描述对病菌进行鉴定。
1.3.2 分子生物学鉴定
根据真菌基因组DNA提取试剂盒（BioFlux 50T）使用步骤，将培养6 d的3个病原菌进行DNA提取。选用真菌通用rDNA-ITS区域引物ITS1/ITS4，以及链格孢菌的特异性引物（Histone3）H3-1 a/H3-1b对病原菌DNA进行聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增条件（表1）参考焦瑞莲[13]的研究方法。PCR产物于1%琼脂糖凝胶，0.5×TBE缓冲液中电泳30 min（120 V），于凝胶成像系统中检测目标条带，并记录结果。获得的PCR纯化产物送北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，获得的序列在NCBI基因数据库中进行BLAST比对，同时从数据库中下载10条序列相似性高且含rDNA-ITS和H3基因的链格孢属（Alternaria sp.）参考菌株序列。以大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）（ITS和Histone3登录号分别为DQ266216.1和DQ266192.1）作为外群，采用MEGA 7.0软件中邻接法（NJ）构建多基因系统发育树，确定其分类地位。
表1 ITS和H3基因序列PCR扩增引物及条件 |
| 引物 | 引物序列（5'—3'） | 基因 | 扩增条件 |
|---|---|---|---|
| ITS1 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG | ITS | 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸7 min |
| ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||
| H3-1a | ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG | H3 | 96 ℃预变性2 min；96 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，30个循环；72 ℃延伸2 min |
| H3-1b | GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT |
1.4 生物学特性测定
测定不同碳源、pH、温度和光照对病原菌菌落生长的影响。用直径5 mm的灭菌打孔器从培养6 d的菌落边缘取菌饼，转接于新鲜培养皿并在以下条件中进行培养：（1）分别接种于以麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉和蜂蜜为碳源的培养基上；（2）分别接种于pH 5、6、7、8和9的PDA培养基上培养；（3）分别置于15、20、25、30和32 ℃条件下培养；（4）置于24 h完全光照、24 h完全黑暗和12 h光暗交替3种处理的培养箱中，光照强度为5 000 lx。每处理3个重复，培养至第6天时观察菌落形态并用十字交叉法测量菌落直径。
1.5 数据处理与分析
采用SPSS 23.0软件中邓肯氏新复极差法进行差异统计学分析。
2 结果与分析
2.1 病原菌分离
采集田间水稻病样，经过分离纯化与单孢分离，得到纯化菌株，根据菌株在PDA培养基中的菌落形态特征与分生孢子形态，归类相似形态菌株3类，编号为A1～A3。
2.2 致病性测定
病害田间症状主要表现在穗部，发病水稻颖壳上出现褐色斑点，病斑呈不规则形，发病重的稻粒空瘪，穗部较薄弱的颖壳发病后呈白色。以接种无菌水为对照，病原菌接种健康稻穗后均可引起水稻穗部发病，产生黄褐色至褐色病斑，布满颖壳，其症状与田间自然发病症状一致（图1）。从发病稻穗上再分离得到的菌株在PDA平板上培养，观察到菌落特性及分生孢子形态特征与纯化所得原菌株一致。
2.3 菌落形态学观察
病原菌株在PDA培养基上25 ℃黑暗恒温培养6 d，菌落平均直径为5.43～6.10 cm，菌落初期呈灰白色，后期底部呈浅灰色或灰橄榄绿，有时中心呈白色，菌落表面有灰白色棉毡状菌丝，气生菌丝多，生长较快，边缘有浅黄色绒毛状晕圈；分生孢子梗单生，曲膝状弯曲，大小在（23.0～65.0）μm×（3.0～4.5）μm；分生孢子链生，且链不分枝；分生孢子具1～3个横隔，较粗，0～2个纵隔，0～1个斜隔，分隔处略缢缩，浅褐色或深褐色，棒形、卵形、倒梨形或近椭圆形，表面光滑，孢子大小（8.31～36.13）μm×（4.11～9.00）μm；分生孢子有喙或无喙，喙呈短棒状，淡褐色，大小（0～3.54）μm×（0～2.59）μm。其形态特征与链格孢菌（A. alternata）一致，如图2所示。
2.4 病原菌的分子生物学鉴定及系统发育树构建
利用rDNA-ITS基因引物对3个供试菌株进行PCR扩增后测序，获得长度分别为627、576和580 bp的DNA片段，在GenBank数据库经BLAST比对，菌株（A1～A3）与链格孢菌（A. alternata）（登记号MF422130.1、KR822138.1和MK640599.1）同源性在99.31%～99.65%。基于rDNA-ITS区引物无法确定其归属[14]，用组蛋白3基因引物H3-1a/H3-1b进行PCR扩增，获得长度分别为440和438 bp的DNA片段，经BLAST比对，菌株（A1～A3）与链格孢菌（A. alternata）（登记号MK799610.1、MN481961.1和MK799475.1）同源性达99.25%～99.75%。对供试菌株（A1～A3）进行ITS/H3联合序列系统发育树构建（图3），结果显示，A1、A2和A3菌株聚在2个分支上，但均与链格孢菌（A. alternata）聚在一起，外群大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）与链格孢属真菌聚为2个分支。
以形态学为基础，结合rDNA-ITS和组蛋白3基因序列及多基因联合发育树分析，确定分离到的菌株均为链格孢菌（A. alternata）。
2.5 病原菌的生物学特性
2.5.1 不同碳源对菌落生长的影响
A1～A3在5种碳源培养基上均可生长，同一菌株在不同碳源培养基上的生长速率存在差异（表2），A1和A3菌落大小差异明显，最大直径为（7.22±0.021）cm，最小为（5.46±0.023）cm；A2菌落在以蜂蜜为碳源的培养基上生长速率最差，直径（4.88±0.033）cm，在其他4种碳源培养基上菌落大小基本一致。3株病原菌均在以蔗糖为碳源的培养基上生长最快，菌落直径最大。
表2 不同碳源的培养基对链格孢菌菌落生长的影响 |
| 碳源 | 菌落直径/cm | ||
|---|---|---|---|
| A1 | A2 | A3 | |
| 麦芽糖 | 6.25±0.065 b | 5.58±0.020 b | 6.18±0.017 c |
| 蔗糖 | 7.18±0.048 a | 5.96±0.024 a | 7.22±0.021 a |
| 葡萄糖 | 5.58±0.097 d | 5.56±0.029 b | 6.00±0.088 d |
| 可溶性淀粉 | 6.01±0.004 c | 5.91±0.047 a | 5.66±0.026 e |
| 蜂蜜 | 5.46±0.023 d | 4.88±0.033 c | 6.29±0.061 b |
|
2.5.2 不同pH对菌落生长的影响
病原菌在pH 5～9的培养基上均可生长（表3），pH在5～7时菌落生长速率较快，直径较大，pH在8～9时，菌落生长速率明显变慢，直径变小，说明该病原菌适合在中性稍偏酸的环境下生长。
表3 不同pH对链格孢菌菌落生长的影响 |
| pH | 菌落直径/cm | ||
|---|---|---|---|
| A1 | A2 | A3 | |
| 5 | 6.37±0.088 a | 5.27±0.088 ab | 6.86±0.087 a |
| 6 | 6.20±0.058 ab | 5.53±0.176 a | 6.67±0.088 a |
| 7 | 6.03±0.088 bc | 5.43±0.145 a | 6.70±0.058 a |
| 8 | 5.90±0.058 cd | 5.03±0.088 bc | 6.10±0.058 b |
| 9 | 5.77±0.088 d | 4.83±0.064 c | 5.83±0.120 b |
2.5.3 不同温度对菌落生长的影响
病原菌对温度的适应能力较强（表4），不同温度下生长速率存在差异。在15～32 ℃范围内均可以生长，15～20 ℃培养条件下菌落生长较缓慢，25～32 ℃时生长较快。30 ℃时，A1～A3菌落直径分别为（7.80±0.057）、（6.57±0.066）和（7.70±0.057）cm，高于30 ℃时菌落生长速率有变慢趋势，直径变小。
表4 温度对链格孢菌菌落生长的影响 |
| 温度/℃ | 菌落直径/cm | ||
|---|---|---|---|
| A1 | A2 | A3 | |
| 15 | 3.80±0.058 e | 3.40±0.057 d | 3.60±0.057 c |
| 20 | 5.30±0.058 d | 5.20±0.057 c | 6.63±0.033 b |
| 25 | 7.27±0.088 b | 6.20±0.057 b | 6.76±0.033 b |
| 30 | 7.80±0.057 a | 6.57±0.066 a | 7.70±0.057 a |
| 32 | 6.60±0.057 c | 6.40±0.057 a | 7.80±0.057 a |
2.5.4 不同光照对菌落生长的影响
光照对病原菌菌落生长速率影响较大（表5），在全光和光暗交替条件下A1菌落生长速率较快，最大直径（7.82±0.036）cm；全光条件下，A2、A3菌株菌落生长速率最快，直径分别为（6.92±0.061）、（7.84±0.012）cm；在完全黑暗条件下，3株病原菌菌落直径分别为（4.11±0.060）、（4.32±0.067）和（3.84±0.031）cm。说明光照对菌落生长具有促进作用，全光照的培养条件更适合该病原菌生长。
表5 不同光照对链格孢菌菌落生长的影响 |
| 光照 | 菌落直径/cm | ||
|---|---|---|---|
| A1 | A2 | A3 | |
| 完全光照 | 7.82±0.036 a | 6.92±0.061 a | 7.84±0.012 a |
| 完全黑暗 | 4.11±0.060 b | 4.32±0.067 c | 3.84±0.031 c |
| 光暗交替 | 7.72±0.052 a | 4.71±0.061 b | 5.18±0.031 b |
3 结论与讨论
本研究报道的水稻褐变穗病病原与已报道的链格孢菌（A. alternata）可以引起水稻褐变穗病结果吻合，而与新疆地区已报道的水稻褐变穗病原不同。如马盾等[10]采用形态学及分子生物学方法鉴定了新疆地区水稻褐变穗病病原，层出镰刀菌（F. proliferatum）为优势致病菌，其次是新月弯孢菌（C. lunata）和细交链孢菌（A. tenuis）。水稻褐变穗病病原菌不一致的原因可能有以下几个方面：一是采集病样的地点环境不同，已报道的水稻病样主要采集于水稻种植区及试验田，属于大田环境；二是采集时间不同，已报道的研究对象采集时间为水稻成熟期（9—10月），杂菌及复合侵染较多，本研究病样采集时间为水稻抽穗期（6—7月），此时病害比较单一；三是不同地区、不同寄主和不同环境中链格孢菌种群结构存在差异，因而侵染后在植物组织上造成的症状及病原也存在差异。
综上，本试验探究了石河子大学农学院试验基地水稻褐变病穗的病原，通过形态学、分子生物学和致病性测定，明确该病害的病原为链格孢菌（A. alternata），并研究了其生物学特性。因在校园试验田小环境中分离鉴定出的菌株较单一，在本文中对该水稻病穗病原菌生物学特性的研究较少，但初步了解了链格孢菌种类及其生物学特性和发病规律，对水稻褐变穗病种类有了进一步的认识，为该病害田间防治及管理提供了参考。