乌鳖返春口服液是一种药食同源类口服液，其结合了药物的治疗作用与食品的安全性，具有治疗部分妇科疾病的功效[1]。其主要功效为补肝肾、健脾胃、调冲任，临床用于治疗卵巢功能早衰及其相关症状，如月经失调、闭经和烘热汗出等[2]。该口服液基于补肾健脾法组方，经过现代制药技术研制而成，原料由鳖甲（炙）、何首乌、枸杞子、白术、茯苓、续断和黄狗肾等构成[3]。
关于该口服液的作用机制，已在其药效、安全性以及临床应用等方面取得了一定的研究进展[1-3]。药效方面，该口服液可一定程度上缓解围绝经期综合征肝肾阴虚症患者的临床症状，降低血清卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）、黄体生成素（Luteinizing hormone，LH）水平，升高雌激素雌二醇（Estradiol，E2）水平，从而明显改善使用者的整体状况。在安全性方面，该口服液展示出良好的安全性，使用者的血常规、尿常规、大便常规以及肝肾功能等各项指标均在正常范围内，未出现明显的不良反应[3]。此外，该口服液的临床应用范围也在不断扩大。作为一种药食同源类口服液，其具有一定的治疗作用，又相对安全，适用于妇科类疾病治疗和康复，但其作用机制有待进一步深入研究。
1 材料与方法
1.1 活性成分筛选和靶点预测
在中药系统药理学数据库（TCMSP）中检索乌鳖返春口服液协定药方中的所有中药材，采用口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18的标准进行主要成分筛选，获得枸杞子、白术、茯苓和续断4种有效成分；再通过中国知网、Pubmed等文献数据库[8]获得鳖甲（炙）、何首乌和黄狗肾3种活性成分。进一步利用PubChem数据库查找该口服液中活性成分的2D结构，利用SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库预测以上活性成分的靶点基因，汇总合并去重后形成该口服液的活性成分作用靶点。
1.2 潜在作用靶点筛选及获取
以“早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）”为关键词，分别在GeneCards、DisGeNE和OMIM数据库进行疾病靶点检索。在GeneCards数据库设定参数relevance score≥5作为筛选条件[9]，筛选结果与DisGeNET和OMIM数据库所得结果合并去重，得到POI疾病靶点。
使用Venny 2.1.0软件导入上述药物活性成分靶点和疾病靶点，绘制韦恩图，所得的交集靶点即为该口服液活性成分的潜在作用靶点。
1.3 蛋白相互作用（PPI）网络构建
采用STRING数据库分析交集靶点，以“Homo sapiens”为物种，设定medium confidence（0.400）得到蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络结果。通过Cytoscape 3.7.2软件分析网络，使用CytoNCA插件得到核心靶点，并作为该口服液治疗POI的关键靶点。
1.4 核心靶点基因富集
挖掘其核心靶点的作用机制，利用DAVID数据库对核心靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析。对GO富集中每项排名前10的条目数据以及KEGG富集结果中排名20的通路数据进行处理，分别导入微生信可视化云平台及Sangerbox 3.0平台，绘制GO富集柱状图和KEGG富集气泡图。
1.5 创建“药物—活性成分—核心靶点”网络
将活性成分与核心靶点、乌鳖返春口服液进行对应，再将核心靶点与POI进行对应，创建Network和Type文件，通过Cytoscape 3.7.2软件构建“药物—活性成分—核心靶点”网络。
2 结果与分析
2.1 活性成分筛选
通过TCMSP数据库筛选获得29个活性成分，其中枸杞子17个、白术1个、茯苓7个和续断4个。另通过文献检索获得46个活性成分，其中鳖甲（炙）4个、何首乌27个和黄狗肾15个。共获得75个乌鳖返春口服液活性成分。
2.2 潜在作用靶点筛选
通过SwissTargetPredicton与Pharmmapper数据库检索，其中SwissTargetPredicton数据库检索得到939个作用靶点，PharmMapper数据库检索得到434个作用靶点。合并去重得到75个活性成分的作用靶点共1 166个。利用GeneCards、DisGeNET和OMIM等数据库共筛选出1 972个POI相关靶点。通过该口服液活性成分的预测靶点交集，得到潜在作用靶点384个，如图1所示。
2.3 PPI网络构建
将384个潜在作用靶点导入STRING数据库，限定物种为“Homo sapiens”，筛选得到交互分数大于0.4的结果，得到383个节点、11 113条边的PPI网络。再导入Cytoscape 3.7.2软件，以平均数为筛选标准，筛选出degree≥58.031 331 592 689 300、betweenness centrality≥367.869 451 697 128和closeness centrality≥0.001 353 103 582 739 770的靶点作为核心靶点，共计75个，作为该口服液的关键靶点，其中TNF、AKT1、JUN、IL6与GAPDH处于机制中的核心位置，节点颜色越深，degree值越大。
2.4 核心靶点基因的GO功能及KEGG通路富集
2.5 “药物—活性成分—核心靶点—疾病”网络创建
该口服液的“药物—活性成分—核心靶点”网络见图3。图中六边形节点代表乌鳖返春口服液，倒三角形节点代表其活性成分，圆形节点代表其核心靶点，连接线代表各节点之间的相互作用。该网络包括148个节点、2 589条边。该口服液中75个成分均参与网络调控，其中大黄酚、洋地黄蒽醌、大黄素甲醚、大黄素-8-甲醚、芹菜素、槲皮素、山柰酚和茯苓酸等化合物具有良好的抗炎活性；豆甾醇、谷甾醇和β-谷甾醇等植物甾醇具有一定的卵巢保护作用；以上化合物均是该口服液的中药活性成分，对其临床应用均可能发挥着一定作用。该口服液以AKT1、TNF和IL6等为核心靶点，可能通过PI3K-Akt、HIF-1、mTOR和FoxO等多条信号通路发挥作用。
3 结论与讨论
黄珊珊[10]研究发现，免疫功能引起的慢性低度炎症可能是导致POI的重要因素之一，患者的中性粒细胞/淋巴细胞比值会明显升高，并且与FSH水平呈正相关，这提示了机体炎症状态可能是发病过程中的关键环节之一。大黄酚、洋地黄蒽醌、大黄素甲醚和大黄素-8-甲醚为蒽醌类成分，具有良好的抗炎活性，大黄蒽醌类化合物通过多靶点、多通路串扰，调控抗炎过程[11]。芹菜素、槲皮素和山柰酚均为黄酮类化合物，具有调节免疫、抗氧化应激和抗炎等作用[12]。因其结构与雌激素相似，可发挥一定程度的雌激素样作用，具有双向调节性[13]。茯苓酸是从茯苓中提取的四环三萜类化合物，具有抗氧化、抗炎和降血糖等作用[14]。临床上主要通过补充外源性雌激素（如戊酸雌二醇等）来改善患者激素状态，在一定程度上缓解不适症状[15]。此外，南楠等[16]研究表明，植物甾醇具有类雌激素作用，能促进内分泌平衡。
本研究中，由核心靶点的PPI网络可知，AKT1、TNF和IL6等为该口服液治疗POI的关键靶点。AKT1作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine kinase proteins，AKT）的亚型之一，在身体各个组织中都有表达[17]，影响细胞增殖、分化、存活和凋亡，对细胞存活至关重要[18]。AKT1活化可以抑制下游促凋亡因子Bad和胱天蛋白酶9（Caspase9）表达，促进颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞凋亡以及卵泡闭锁[19]。KEGG富集结果表明，PI3K-Akt等相关信号通路与POI密切相关。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路是体内的基本信号通路，对卵巢休眠和卵泡的早期激活非常重要，卵泡过度闭合可能会加速卵巢功能衰竭。多项研究表明，在缺氧条件下PI3K-Akt信号通路会被激活，而缺氧的关键因子HIF-1是PI3K-Akt的靶蛋白之一，在维持氧稳态方面发挥着重要作用[16,18]。PI3K-Akt通路激活后可能会增加HIF-1的转录活性，从而导致其过度表达和加速颗粒细胞凋亡，这是促进卵泡闭锁的重要因素。
乌鳖返春口服液是一种结合了药物和食品特性的产品，强调食物与药物之间的互补和协同作用，其不仅具有营养价值，还有助于预防和治疗疾病。基于这一理念，该口服液将中药有效成分与营养丰富的食材相结合，形成了独特的产品，在现代健康管理中发挥一定作用。该类产品可以调节身体机能、增强免疫力、缓解疲劳和改善睡眠质量等，具有广泛的应用前景和市场需求。随着人们对健康生活的追求和对药食同源理念的深入认识，该类产品有望得到更多关注和更远发展。
综上，本研究基于网络药理学方法探究了药食同源乌鳖返春口服液的作用机制，分析其主要活性成分、关键靶点及信号通路。结果表明，该口服液可能是通过大黄蒽醌类、黄酮类和植物甾醇类化合物等活性成分，以AKT1、TNF和IL6等作为核心靶点，通过PI3K-Akt、HIF-1、mTOR和FoxO等多条信号通路来发挥作用。本研究可为药食同源口服液的进一步试验及临床研究提供参考，相关研究结果仍有待开展进一步的生物学验证。