1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
供试芽孢菌株为枯草芽孢杆菌黑色变种（ATCC 9372），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC 21608）。
1.1.2 培养基和试剂
营养琼脂、营养肉汤、蛋白胨、胰蛋白胨、酪氨酸、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、七水硫酸镁、L‑天冬酰胺、L‑酪氨酸、干酪素和氢氧化钠，均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 主要仪器和设备
恒温培养箱（BSD-250，上海博迅）；超净工作台（BLB-1300，苏州净化）；pH计（F2，Mettler Toledo）；分析天平（ME204E，Mettler Toledo）；高压蒸汽灭菌器（LDZF-50 L，上海申安）。
1.2 培养条件
取枯草芽孢杆菌黑色变种（CICC 21608）冻干菌种管，无菌条件下打开，用刻度移液管吸取适量营养肉汤培养基，吹打数次，使其融化分散。取含5～10 mL营养肉汤培养基的试管，滴入少许菌种悬液，置36 ℃复苏培养18～24 h。用接种环取复苏培养后的菌悬液，划线接种于营养琼脂平皿上，于36 ℃培养箱培养18～24 h。挑取营养琼脂平皿上的单菌落接种于酪氨酸培养基上，于36 ℃培养24～96 h。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基组分优化
参考ISP medium No.7基础培养基配方，以L-天冬酰胺0.5 g、L-酪氨酸0.5 g、磷酸氢二钾0.5 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钠0.5 g、琼脂20.0 g、微量盐溶液1 mL和蒸馏水1 000 mL作基础培养基，以基础培养基为对照，采用单因素实验法探讨培养基中酪氨酸、葡萄糖、干酪素和胰蛋白胨浓度及培养时间对枯草芽孢杆菌黑色变种产生黑色菌落的影响。基础培养基和优化培养基的成分及各成分含量见表1。
表1 培养基成分及浓度 |
| 培养基成分 | ISP medium No.7 | 优化培养基 |
|---|---|---|
| L-天冬酰胺/（g/L） | 0.5 | 0.5 |
| L-酪氨酸/（g/L） | 0.5 | 0～3.0 |
| 胰蛋白胨/（g/L） | 0 | 0.5～5.0 |
| 干酪素/（mL/L） | 0 | 10～60 |
| 葡萄糖/（g/L） | 0 | 0～3.0 |
| 磷酸氢二钾/（g/L） | 0.5 | 0.5 |
| 七水硫酸镁/（g/L） | 0.5 | 0.5 |
| 氯化钠/（g/L） | 0.5 | 0.5 |
| 琼脂/（g/L） | 20 | 20 |
| 微量盐溶液/（mL/L） | 1 | 1 |
配制不同含量的L-酪氨酸优化培养基（1 000 mL基础培养基，分别加入L-酪氨酸0、0.5、1.0、2.0和3.0 g）、葡萄糖（碳源）优化培养基（1 000 mL基础培养基，分别加入葡萄糖0、0.5、1.0、2.0和3.0 g）、胰蛋白胨（氮源）优化培养基（1000 mL基础培养基，分别加入胰蛋白胨0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 g）和干酪素（氨基酸）优化培养基（1 000 mL基础培养基，分别添加干酪素10.0、20.0、40.0和60.0 mL），以每皿25～30 mL制备平皿，冷却凝固后备用。在优化培养基平皿上分别涂布接种0.1 mL 浓度3.0×103 cfu/mL的枯草芽孢杆菌黑色变种菌液，在培养24、48、72和96 h后分别计数优化培养基平皿上的黑色菌落数。
1.3.2 诱导时间优化
考虑到温度和pH对黑色素的产生影响不大，而培养时间对其影响较明显，因而在培养条件方面主要针对培养时间开展研究。试验设定了24、48、72和96 h 4个不同的诱导时间，研究并优化枯草芽孢杆菌黑色变种稳定产生黑色素的诱导时间。
1.4 优化培养基适用性验证
为验证优化培养基的效果，采用市面上的枯草芽孢杆菌黑色变种产品进行验证。分别为富捷牌环氧乙烷灭菌ATCC 9372生物指示剂、鑫四环牌生物指示剂ATCC 9372菌片、鸿雍牌ATCC 9372生物指示剂和3M牌环氧乙烷灭菌生物培养指示剂。
1.5 测定指标和方法
采用稀释涂布平板计数法测定活菌量。取待测发酵液稀释104～105 倍，分别吸取100 μL于选择培养基上，用无菌涂布棒将稀释菌液涂抹均匀。为防止在培养过程中被污染，将培养皿用封口膜密封后，于36 ℃培养箱培养24～96 h，计数各培养皿菌落数及黑色菌落数。
1.6 数据分析
使用Excel 2013软件进行数据统计处理。
2 结果与分析
2.1 培养基组分优化
2.1.1 L-酪氨酸含量
培养过程中发现，当培养基中不含L-酪氨酸时，培养至96 h仍未见有黑色菌落形成；当酪氨酸浓度在0.5～3.0 g/L时，培养期间有不同程度的黑色菌落形成。由此可见，酪氨酸是合成黑色素的前提。由表2可知，当培养基中L-酪氨酸浓度在0.5～1.0 g/L时，培养48 h即可见黑色菌落形成，至72 h黑色菌落形成率达100%；当L-酪氨酸浓度为2.0 g/L时，培养72 h才开始形成明显的黑色菌落，培养至96 h时黑色菌落形成占比99.2%；当酪氨酸浓度为3.0 g/L时，培养96 h才形成明显黑色菌落，且黑色菌落形成占比94.7%。由此可见，培养基中最优酪氨酸浓度0.5 g/L，此时黑色菌落形成速率较快，且培养72 h后黑色菌落形成率100%。
表2 不同L-酪氨酸浓度下枯草芽孢杆菌黑色变种黑色菌落形成情况 |
| L-酪氨酸 浓度/（g/L） | 黑色菌落占比/% | |||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | 96 h | |
| 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 0.5 | 0 | 90.0 | 100 | 100 |
| 1.0 | 0 | 75.0 | 100 | 100 |
| 2.0 | 0 | 0 | 93.6 | 99.2 |
| 3.0 | 0 | 0 | 0 | 94.7 |
2.1.2 碳源含量
为探讨碳源对枯草芽孢杆菌黑色变种的生长影响，以葡萄糖作为碳源代表。结果见图1和表3。由图1可知，当基础培养基中不添加葡萄糖时，培养24 h时后枯草芽孢杆菌黑色变种生长情况明显较添加葡萄糖的差，菌落数量少且个体小，表明碳源是构成微生物细胞的碳架和供给微生物生长、繁殖及运动所需能量的物质，培养基中增加碳源可以促进枯草芽孢杆菌黑色变种的生长。由表3可知，当培养基中葡萄糖浓度在0.5～2.0 g/L时，培养96 h黑色菌落形成率均达100%。其中，当培养基中葡萄糖浓度在0.5～1.0 g/L时，培养48 h时出现黑色菌落，至72 h黑色菌落占比分别为100%、99.8%，而当葡萄糖浓度在1.5～2.0 g/L时，培养72 h时才出现黑色菌落，黑色菌落产生速度开始逐渐变慢，这可能与细菌的生长特性相关，枯草芽孢杆菌黑色变种虽然能利用酪氨酸酶分解酪氨酸产生黑色素，但当其生长的培养基中含有丰富的碳源、氮源时，优先利用碳源、氮源进行生长。因此，葡萄糖的最优添加浓度0.5 g/L，培养72 h时，枯草芽孢杆菌黑色变种黑色菌落形成率达100%。
2.1.3 氮源含量
为探讨氮源对枯草芽孢杆菌黑色变种的生长影响，以胰蛋白胨作为氮源代表。试验结果见图2和表4。由图2可知，当基础培养基中不添加胰蛋白胨时，培养24 h后平皿上几乎没有枯草芽孢杆菌黑色变种菌落生长，直至培养72 h才出现明显菌落生长，96 h后形成黑色菌落比例较高。而在添加胰蛋白胨的培养基平板上，培养24 h后即出现菌落且生长良好，个体较大；培养48 h开始出现黑色菌落，至72 h黑色菌落占比高达100%。可见，氮源作为微生物合成蛋白质的主要原料之一，是微生物生长不可或缺的营养物质，增加氮源可以明显促进枯草芽孢杆菌黑色变种的生长。
表4 不同胰蛋白胨浓度下枯草芽孢杆菌黑色变种黑色菌落形成情况 |
| 胰蛋白胨 浓度/（g/L） | 黑色菌落占比/% | |||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | 96 h | |
| 0.5 | 0 | 90.0 | 100 | 100 |
| 1.0 | 0 | 79.2 | 100 | 100 |
| 2.0 | 0 | 79.9 | 100 | 100 |
| 3.0 | 0 | 79.4 | 100 | 100 |
| 4.0 | 0 | 72.5 | 100 | 100 |
| 5.0 | 0 | 0 | 99.5 | 100 |
由表4可知，当培养基中胰蛋白胨浓度在0.5～5.0 g/L时，培养96 h后黑色菌落形成率均达100%。其中，当培养基中胰蛋白胨浓度在0.5～4.0 g/L时，培养48 h时均开始形成黑色菌落，黑色菌落占比72.5%～90.0%，且胰蛋白胨浓度为0.5 g/L时黑色菌落形成率最高，培养至72 h时黑色菌落占比均达到100%；而当胰蛋白胨浓度为5.0 g/L时，培养48 h时黑色菌落占比0%，培养72 h出现黑色菌落，菌落生长速度有所减缓。由此可见，胰蛋白胨最优添加浓度0.5 g/L，在该浓度下枯草芽孢杆菌黑色变种产生黑色菌落时间早、比例高。
2.1.4 氨基酸含量
表5 不同干酪素浓度下枯草芽孢杆菌黑色变种黑色菌落形成情况 |
| 干酪素浓度/（mL/L） | 黑色菌落占比/% | |||
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | 96 h | |
| 0 | 0 | 64.6 | 100 | 100 |
| 10.0 | 0 | 90.0 | 100 | 100 |
| 20.0 | 0 | 55.5 | 100 | 100 |
| 40.0 | 0 | 50.3 | 100 | 100 |
| 60.0 | 0 | 12.1 | 100 | 100 |
综上，L-酪氨酸、葡萄糖、胰蛋白胨和干酪素的最优添加浓度分别为0.5 、0.5 、0.5 g/L和10 mL/L。优化后每1 000 mL枯草芽孢杆菌黑色变种培养基的成分见表6。
表6 优化后的培养基成分 |
| 培养基成分 | 组分浓度 |
|---|---|
| L-天冬酰胺/（g/L） | 0.5 |
| L-酪氨酸/（g/L） | 0.5 |
| 胰蛋白胨/（g/L） | 0.5 |
| 干酪素/（mL/L） | 10.0 |
| 葡萄糖/（g/L） | 0.5 |
| 磷酸氢二钾/（g/L） | 0.5 |
| 七水硫酸镁/（g/L） | 0.5 |
| 氯化钠/（g/L） | 0.5 |
| 琼脂/（g/L） | 20.0 |
| 微量盐溶液/（mL/L） | 1.0 |
2.2 培养时间优化
将枯草芽孢杆菌黑色变种接种于优化后的酪氨酸培养基上，培养24 h时，无黑色菌落生成，随着培养时间的增加，黑色素不断生成，黑色菌落逐渐生成，诱导48 h时；黑色菌落生成比占比99.3%，培养72～96 h可得到较为明显和稳定的黑色菌落，占比达100%。因此，枯草芽孢杆菌黑色变种的最优培养时间在72～96 h。
2.3 诱导培养基适用性验证
3 结论与讨论
酪氨酸在酪氨酸氧化酶的催化作用下氧化生成二羟苯丙氨酸（多巴），继续氧化生成多巴醌，再进一步氧化闭环生成5,6-二羟吲哚，再转化成5,6-吲哚二醌，在酶的作用下，最终氧化聚合形成黑色素[7-8]。本试验进一步验证了酪氨酸是枯草芽孢杆菌黑色变种产生黑色素并形成黑色菌落的关键物质。试验结果表明，葡萄糖、胰蛋白胨以及干酪素分别作为碳源、氮源及氨基酸均能促进菌体快速生长，但过量的碳源、氮源和氨基酸会影响枯草芽孢杆菌黑色变种分解利用酪氨酸的效率，与马顶虹[9]研究结果一致。因此，培养基成分的合理配比对是确保枯草芽孢杆菌黑色变种快速稳定产生黑色菌落的关键。优化后的酪氨酸培养基可以使枯草芽孢杆菌黑色变种的培养时间稳定在72～96 h，解决了枯草芽孢杆菌黑色变种在含有酪氨酸的培养基中黑色素形成不稳定的问题，为枯草芽孢杆菌黑色变种的选择性培养及筛选提供参考。
本研究采用了单因素实验法探讨了不同培养基成分及培养时间对枯草芽孢杆菌黑色变种形成黑色素的影响，但未考虑各因素之间的相互作用。响应面法是目前较为常用的微生物培养基优化方法之一，是一种处理复杂关系和优化多种因素的实验统计方法[10]，可缩短优化时间、提高应用可信度[11]。张梦菲等[12]通过响应面法优化暹罗芽孢杆菌产大环内酯的发酵培养条件，得出的发酵培养基明显提高菌株的大环内酯产量。后续可以根据单因素实验的结果，以碳源、氮源、氨基酸、酪氨酸、无机盐和培养时间等作为影响因素设计响应面优化试验，进一步优化培养基各组分的添加比例，提高黑色菌落的生长效率，为枯草芽孢杆菌黑色变种的应用和检测鉴定提供基础。黑色素被定义为由酚类前体氧化聚合而产生的棕色到黑色的高分子量色素，具有保护生物体免受不同的外界压力，包括紫外线照射、高温和活性氧等，还可以结合金属离子和自由电子，从而发挥氧化还原作用[13]。随着明黑色素在工业、农业、食品和医药领域应用范围的扩大[14-16]，结合枯草芽孢杆菌黑色变种具有的非致病性、易培养和生产快等优势[17]，可考虑将其应用于黑色素规模化生产。
综上，本研究通过单因素实验法探讨培养基中酪氨酸、葡萄糖、胰蛋白胨和干酪素浓度及培养时间对枯草芽孢杆菌黑色变种产生黑色菌落的影响。优化后的酪氨酸培养基配方为每1 000 mL培养基中含胰蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，七水硫酸镁0.5 g，L-天冬酰胺1.0 g，L-酪氨酸0.5 g，干酪素溶液10.0 mL，微量盐溶液1.0 mL，琼脂20.0 g，余量为蒸馏水。采用优化培养基36 ℃培养箱下培养72～96 h可得到稳定的黑色菌落。通过4种枯草芽孢杆菌黑色变种验证其适用性，结果表明该条件有利于诱导枯草芽孢杆菌黑色变种稳定产生黑色素，为该物种的选择性培养及筛选提供参考。