水稻是重要的粮食作物之一，对保障粮食生产安全发挥重要作用。实际生产栽培中，其产量可能受水稻种子老化的影响，如水稻种子老化劣变，导致其发芽率和发芽势降低，严重的可能完全失去活性，最终导致粮食产量降低[1-2]。
种子的耐储藏特性是作物农艺性状的一个重要指标，其影响着作物产量和质量[3]。目前，采用老化处理方法来研究种子的耐储藏特性的相关研究较多，利用高温高湿条件加速种子老化劣变，使其达到预期的衰老状态，相较于自然老化，该方法用时较短、因素可控[4]。为探究人工老化处理和自然老化处理两种状态的相关性，董国军等[5]对56份具有代表性的水稻材料（包括籼稻品种和粳稻品种）进行自然老化处理和人工老化处理，对其发芽等相关指标进行分析，结果表明，人工老化处理效果和自然老化处理效果基本相吻合，其相关系数约0.89，证明人工老化可以部分替代自然老化应用于水稻品种耐储藏特性的评价和筛选。相关学者针对人工老化处理对种子生理指标的影响展开了大量研究，如杨亚平等[6]以2个常规稻（99早677、湘早籼24号）和2个杂交稻（株两优819、株两优02）为材料进行老化试验发现，相同品系种子活力越低，该品系水稻种子浸出液电导率越高，其蛋白质含量明显下降，游离氨基酸含量明显增加，过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性降低；各水稻品系间的变化幅度有所不同。钟希琼等[7]对南丝占、佛农占等7个水稻品种进行老化试验发现，水稻种子的活力与CAT活性、过氧化物酶（Peroxide，POD）活性无线性相关，而与呼吸速率呈明显正相关。蔡秋华等[8]以明恢86、R527等水稻品种为研究材料，以具有耐储藏性的云恢290作为对照进行老化试验，结果表明，老化处理后，水稻品种的蛋白质含量未出现明显变化，而淀粉和脂肪酶的含量有所增加。
为进一步完善水稻种子人工模拟老化相关研究，本试验利用LQ183、LQ189和LQ192等8份水稻品种，运用人工模拟种子老化方法，探究其生理生化特性变化，为量化水稻种子质量以及筛选具有较好耐储藏特性的水稻品种提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试水稻品种包括LQ183、LQ189、LQ192、LQ196、FS2、FS7、FS20和FS23，其中LQ183、LQ189和LQ196为籼稻品种，LQ196、FS20和FS23为粳稻品种，FS2、FS7为特种稻品种，试验材料来自不同稻区，具有较好的代表性。2年的自然老化预备试验结果表明，LQ189，LQ192和LQ196这3个品种的耐储藏性较好。
1.2 试验方法
1.2.1 预备试验
根据人工老化方法，称取16 g种子置于老化盒中，将其放入盛有40 mL蒸馏水的发芽盒中，密封好盒盖，随后将其置于老化箱中分别进行5、10和15 d的老化处理。老化种子多数发霉，故在老化处理前分别采用75%乙醇溶液、1% HgCl2溶液和0.5% NaClO溶液对待老化的种子进行消毒处理5 min，并用无菌水冲洗5～6次，发现乙醇溶液和NaClO溶液处理的种子发霉情况得到了一定程度的改善。将预试验处理的老化种子进行标准发芽试验，发现8个品种的发芽势和发芽率均降低，说明老化效果较好，方法适用。
1.2.2 人工加速老化试验
在试验开展前严格控制水稻种子的含水量在10%～14%，若含水量低于10%，可将其置于高湿环境中吸收水分，若含水量高于14%，则置于30 ℃烘箱中进行干燥处理。
将32个老化盒用水冲洗干净，使用75%乙醇对老化盒、人工种子老化箱及其他有关器材进行擦拭消毒，打开人工种子老化箱的紫外灯灭菌30 min，称取17 g种子均匀平摊在老化盒中（不对种子进行消毒处理，以防影响其发芽能力），老化盒侧身贴相应标签，调节老化箱内温度43 ℃，利用外接加湿器控制箱内湿度99%，分别进行3、6、9和12 d的老化处理，到规定日期时取出老化种子放入4 ℃低温低湿冷藏柜内储存，以备后续试验使用。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 种子浸出液电导率的测定
称取10粒经过老化处理的水稻种子的重量，用蒸馏水冲洗种子后吸干残余水分，装入烧杯中，倒入50 mL蒸馏水，用电导仪测定此时的电导率，随后在烧杯口紧贴一层透明薄膜，置于20 ℃培养箱中24 h，取出烧杯，测量此时的电导率，种子浸出液电导率的计算如式（1） 。
种子浸出液电导率[uS/（cm·g）]=（d 2－d 1）/W
1.3.2 POD活性的测定
采用愈创木酚法进行POD活性测定，取3粒经过老化处理的水稻种子称重，加入Tris-HCl溶液5 mL，冰浴研磨，将研磨好的浆液移入离心管内，离心15 min，取3个比色皿加入3 mL POD混合液，其中1个加入1 mL的Tris-HCl溶液作为空白对照，其他比色皿各加入1 mL的粗酶液，在470 nm的波长下连续读取吸光值。POD活性计算如式（2） 。
POD活性（U/g）=（ΔA 470×V t）/（W×V s×0.01×t）
1.3.3 单粒核苷酸含量的测定
取1粒经过老化处理的水稻种子称重，放入试管中加入10 mL蒸馏水，在试管上紧贴一层薄膜，在恒温下放置24 h，取3 mL溶液在260 nm波长下读取吸光值。单粒核苷酸的含量计算如式（3） 。
单粒核苷酸含量（μg/mL）=A 260/0.02
1.3.4 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量的测定
取3粒经过老化处理的水稻种子称重，加入1%三氯醋酸溶液10 mL充分研磨，将研磨浆液放入离心机中离心10 min。取2 mL上清液加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液（对照加2 mL蒸馏水），分别在600、532和450 nm波长下读取相应的吸光值。MDA含量计算如式（4 ）～（5 ）。
C（μmol/L）=6.45（A 532－A 600）/0.56A 450
MDA含量（μmol/g FW）=（C×V）/（1 000×W）
式（4 ）～（5 ）中，A 532、A 600和A 450为532、600和450 nm波长下的吸光值；C为提取液中MDA的浓度；V为提取液的总体积，mL。
1.3.5 可溶性蛋白含量的测定
采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶蛋白含量，取3粒经过老化处理的水稻种子称重，加入蒸馏水研磨，将得到的浆液装入离心管中，离心10 min，取上清液转入10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。在试管中按规定加入药剂（标准曲线1号做对照），在595 nm波长下读取吸光值。可溶蛋白的含量计算如式（6） 。
可溶性蛋白的含量（mg/g）=（C×V t）/（1 000×V s×W）
1.3.6 可溶性糖含量的测定
利用蒽酮法测定可溶性糖含量，取3粒经过老化处理的水稻种子称重，放入试管中加入6 mL蒸馏水，用透明薄膜紧贴试管口，置于沸水浴中提取溶液，将提取液转入容量瓶内定容，随后吸取0.5 mL样液，按规定加入药剂（标准曲线1号作为对照），在620 nm波长下读取吸光值。可溶性糖的含量计算如式（7） 。
可溶性糖含量（%）=（C×V t）/（V s×W×106）×100
1.4 数据处理分析
采用Excel软件进行数据整理，SPSS软件对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 老化水稻种子浸出液电导率
表1 老化水稻种子浸出液电导率数据的方差分析结果 |
| 变异来源 | DF | SS | MS | F | F 0.05 | F 0.01 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 重复 | 2 | 157.82 | 78.91 | 2.17 | 3.74 | 6.51 |
| 品种 | 7 | 5 274.32 | 753.47 | 20.72** | 2.76 | 4.28 |
| 主区误差 | 14 | 509.20 | 36.37 | |||
| 主区总变异 | 23 | 5 941.34 | ||||
| 处理 | 3 | 36 336.60 | 12 112.20 | 376.37** | 2.80 | 4.22 |
| 品种处理 | 21 | 1 678.64 | 80.36 | 2.50** | 1.79 | 2.28 |
| 副区误差 | 48 | 1 544.73 | 32.18 | |||
| 总变异 | 95 | 4 510.31 |
|
表2 不同品种老化水稻种子浸出液电导率的统计分析结果单位：[uS/（cm·g）] |
| 品种 | 电导率 |
|---|---|
| FS2 | 47.54 Aa |
| FS7 | 43.10 ABab |
| LQ189 | 41.80 ABab |
| FS23 | 41.20 ABab |
| FS20 | 36.80 ABb |
| LQ192 | 32.05 Bb |
| LQ196 | 31.83 Bb |
| LQ183 | 22.88 Bc |
|
表3 老化处理天数的水稻种子浸出液电导率的统计分析结果 |
| 老化天数/d | 电导率/[uS/（cm·g）] |
|---|---|
| 0 | 12.13 Dd |
| 3 | 26.65 Cc |
| 6 | 46.35 Bb |
| 9 | 63.48 Aa |
综上所述，水稻种子浸出液电导率随着老化处理天数的增加而提高，不同品种的电导率变化存在差异。
2.2 老化水稻种子POD活性
表4 老化水稻种子POD活性数据的方差分析结果 |
| 变异来源 | DF | SS | MS | F | F 0.05 | F 0.01 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 重复 | 2 | 1.01 | 0.51 | 0.47 | 3.74 | 6.51 |
| 品种 | 7 | 1 232.16 | 176.02 | 162.88** | 2.76 | 4.28 |
| 主区误差 | 14 | 15.13 | 1.09 | |||
| 主区总变异 | 23 | 1 248.30 | ||||
| 处理 | 3 | 4 280.24 | 1 426.75 | 843.71** | 2.80 | 4.22 |
| 品种处理 | 21 | 6 228.58 | 296.60 | 175.39** | 1.79 | 2.28 |
| 副区误差 | 48 | 81.17 | 1.69 | |||
| 总变异 | 95 | 11 838.29 |
表5 不同品种老化水稻种子POD活性统计分析结果单位：（U/g） |
| 品种 | POD活性 |
|---|---|
| LQ196 | 29.72 Aa |
| FS7 | 24.70 Bb |
| FS2 | 22.09 Cc |
| LQ183 | 20.27 Dd |
| FS23 | 19.92 Dd |
| FS20 | 19.43 Dd |
| LQ192 | 18.97 Dd |
| LQ189 | 18.33 Dd |
表6 老化处理天数对水稻种子POD活性统计分析结果 |
| 老化天数/d | POD活性/（U/g） |
|---|---|
| 0 | 63.48 Aa |
| 3 | 46.35 Bb |
| 6 | 26.65 Cc |
| 9 | 12.13 Dd |
综上所述，不同水稻品种的POD活性随着老化天数的增加，其变化趋势不同，但整体呈现降低趋势。
2.3 老化水稻种子单粒核苷酸含量
表7 老化水稻种子单粒核苷酸含量数据的方差分析结果 |
| 变异来源 | DF | SS | MS | F | F 0.05 | F 0.01 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 重复 | 2 | 0.52 | 0.26 | 1.73 | 3.74 | 6.51 |
| 品种 | 7 | 189.24 | 27.03 | 180.23** | 2.76 | 4.28 |
| 主区误差 | 14 | 2.10 | 0.15 | |||
| 主区总变异 | 23 | 191.86 | ||||
| 处理 | 3 | 16.12 | 5.37 | 22.68** | 2.80 | 4.22 |
| 品种处理 | 21 | 127.49 | 6.07 | 25.63** | 1.79 | 2.28 |
| 副区误差 | 48 | 11.37 | 0.24 | |||
| 总变异 | 95 | 346.84 |
从品种和老化处理时间方面对数据进行统计分析，结果如表8～9所示。由表8可知，品种FS2的单粒核苷酸含量最高（4.95 μg/mL），与其他品种差异存在统计学意义（P<0.01），FS23次之（4.11 μg/mL），与其他品种差异存在统计学意义（P<0.05），品种FS7和FS20的单粒核苷酸含量间差异无统计学意义（P>0.05），均与其他品种差异存在统计学意义（P<0.05），品种LQ192、LQ183和LQ196的单粒核苷酸含量较低（0.76～1.11 μg/mL），差异无统计学意义（P>0.05），与其他品种差异均存在统计学意义（P<0.05）。由表9可知，不同处理天数的水稻种子的单粒核苷酸含量间差异无统计学意义（P>0.05）。
表8 不同品种老化水稻种子单粒核苷酸含量的统计分析结果单位：（μg/mL） |
| 品种 | 单粒核苷酸含量 |
|---|---|
| FS2 | 4.95 Aa |
| FS23 | 4.11 Bb |
| FS7 | 3.36 Bc |
| FS20 | 3.00 Bc |
| LQ189 | 1.54 Cd |
| LQ192 | 1.11 Cf |
| LQ183 | 1.10 Cf |
| LQ196 | 0.76 Cf |
表9 老化处理天数对老水稻种子单粒核苷酸含量的统计分析结果 |
| 老化天数/d | 单粒核苷酸含量/（μg/mL） |
|---|---|
| 0 | 3.03 Aa |
| 3 | 2.56 Aa |
| 6 | 2.31 Aa |
| 9 | 1.90 Aa |
综上所述，随着老化处理天数的增加，部分品种的单粒核苷酸的含量有所增加，而品种FS2、FS7、FS20和FS23的单粒核苷酸含量在老化处理阶段出现降低趋势，线性关系不明显。
2.4 老化水稻种子MDA含量
2.5 老化水稻种子可溶性蛋白含量
2.6 老化水稻种子可溶性糖含量
3 结论与讨论
制备水稻老化种子是研究人工老化处理对种子生理生化特性影响的基础之一。人工老化处理方法应用于种子耐储藏特性的研究中，具有时间较短等优势。何龙生等[9]研究发现，随着老化天数的增加，水稻种子的发芽势和发芽率均明显降低。本试验通过分析人工老化处理对种子生理生化特性的影响发现，品种LQ183、LQ192和LQ196的种子活力较高、耐储藏性较好，与自然老化得出LQ189、LQ192和LQ196耐储藏性较好的结果基本吻合，说明人工老化试验可以应用于种子耐储藏特性的研究中。此次人工老化处理试验设置老化天数0、3、6、9和12 d，而实际观察时发现，老化处理12 d的水稻种子出现发霉现象，故本次人工老化处理对种子生理生化特性的影响研究只选用人工老化处理3、6和9 d和未经过人工老化处理的水稻种子。
水稻种子生活细胞的正常代谢活动依赖于种子内部细胞器及细胞膜的完整性。高家东等[10]研究指出，衰老水稻种子的膜系统损伤一般较严重，膜的修复能力较弱，部分衰老水稻种子甚至无法建立起完整的膜结构，严重时可能造成膜系统永久性损伤，从而造成水稻种子内部的某些物质流失。种子流失的物质中会存在一些具有导电能力的物质，这些物质流出会造成种子浸出液电导率大幅上升。曲宗普尺等[11]研究指出，膜损伤会引起水稻种子膜透性改变，导致渗出物增多，电导率增加，进而导致种子活力下降。水稻种子的膜脂过氧化现象会使膜脂的含量下降，可能导致MDA等物质产生。在种子衰老过程中，营养物质和大分子物质合成能力受到影响，糖类和蛋白质的合成明显降低；部分酶蛋白变性或辅酶缺少会导致酶活性降低。
本试验利用LQ183、LQ189和LQ192等8份水稻品种，运用人工模拟种子老化方法，探究水稻种子的生理生化特性变化。结果表明，未经老化处理的水稻种子浸出液电导率最低，各个品种水稻种子浸出液电导率随着老化处理天数的增加呈上升趋势；水稻种子POD活性随着老化处理天数的增加，其变化趋势不同，但最终会呈降低趋势。随着老化处理天数的增加，不同水稻种子的单粒核苷酸含量变化趋势不同，部分品种呈持续上升趋势，部分品种呈先上升后降低的变化趋势；水稻种子的MDA的含量会随着老化处理天数的增加呈上升趋势。随着老化处理天数的增加，不同品种水稻种子的可溶性蛋白含量变化趋势不同，部分品种呈先增加后减少的变化趋势，部分品种呈先减少后增多的变化趋势；水稻种子的可溶性糖含量总体呈现上升趋势。
种子衰老是一个复杂多变的过程[12]，影响种子活力的因素较多，如代谢强度、CAT活性等。探究种子衰老在生理生化方面表现出的一系列特性，对于筛选具有良好耐储藏性的水稻材料以及深入研究种子老化机理具有重要作用。