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2025 , Vol. 31 >Issue 1: 67 - 72

DOI: https://doi.org/10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.01.014

Characterization analysis of microsatellite　in　chloroplast　of Spiraea cantoniensis Lour.

  • RAN Xiaoyan ,
  • ZHAO Fang ,
  • LIU Mei ,
  • LONG Yuxin ,
  • HE Yujie ,
  • ZHAO Yuemei
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  • School of Biological Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang 550018, China

Received date: 2024-11-30

  Online published: 2025-01-15

Fold

Abstract

To investigate the characteristics of simple repeat sequences (SSR) in the chloroplast genome of Spiraea cantoniensis Lour., based on the chloroplast genome sequences of Spiraea cantoniensis Lour. collected from GenBank databases, the chloroplast genome characteristics, scattered repeat sequences, and chloroplast microsatellites(cpSSR) features were analyzed using REPuter and MISA software. The results showed that the complete chloroplast genome sequence was 155 932 bp, and it is a typical tetrad structure; 43 interspersed repeat sequences were identified, with the most palindromic repeats and the least complementary repeats. A total of 57 cpSSR loci were identified on the chloroplast genome sequence, mainly distributed in the LSC region. There were 4 types of cpSSR repeat base compositions, namely mononucleotide, dinucleotide, tetranucleotide, and pentanucleotide. Among them, mononucleotide repeat sequences were the most numerous with 45, which accounted for 78.95% of the total repeat sequences, and pentanucleotide repeat sequences had the least, only 1, which accounted for 1.75% of the total repeat sequences. The length range of cpSSR was 10-19 bp, with the highest length being 10 bp, accounting for 43.86%; the copy number of cpSSR motifs in the chloroplasts of Spiraea cantoniensis Lour. varied from 3 to 19, with the most sequences having a copy number of 10, with 25, accounting for 43.86% of the total repeats. This experiment investigated the distribution patterns and characteristics of chloroplast microsatellites of Spiraea cantoniensis Lour., providing a reference for species identification, population genetics, and phylogenetic research of Spiraea.

Key words： Spiraea cantoniensis Lour.; chloroplast genome; interspersed repeat sequences; microsatellite

Cite this article

RAN Xiaoyan , ZHAO Fang , LIU Mei , LONG Yuxin , HE Yujie , ZHAO Yuemei . Characterization analysis of microsatellite　in　chloroplast　of Spiraea cantoniensis Lour.[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2025 , 31(1) : 67 -72 . DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.01.014

绣线菊属（Spiraea）是蔷薇科（Rosaceae）绣线菊亚科（Spiraeoideae）落叶类型中的属，在欧洲、亚洲和北美洲均有分布，我国主要分布于云南、甘肃、内蒙古、陕西、四川和山东等地[1]。该属植物具有耐寒、耐旱、适应性强和易于引种栽培等特点，被广泛应用于园林绿化。在城市园林植物造景中，该属植物可以栽植于水岸、石边、山坡和草坪角隅，起到美化景观、净化空气等作用；其花型雅致，叶型多样，且叶色具有丰富的季相变化，可实现夏季赏花、秋季观叶的景观效果[2-3]。麻叶绣线菊（Spiraea cantoniensis Lour.）是绣线菊属灌木，其高可达1.5 m，小枝细瘦，叶片菱状披针形至菱状长圆形；伞形花序，花瓣近圆形或倒卵形，白色，蓇葖果。该植物4—5月开花，7—9月结果[4]。花色鲜艳、叶型多样且株型奇特，具有较高的观赏价值；同时因其萌蘖性强且花期长，在园林绿化中常被用作绿篱，可形成花带并起到阻隔作用。此外，麻叶绣线菊的根、叶和果实具有清热、凉血、祛瘀和消肿止痛等功能，可用于治疗跌打损伤、疥癣等，具有较高的药用价值[5]。
微卫星（Microsatellite）又称简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR），是一种常用的以聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）为基础的DNA分子标记技术，由1～6个重复核苷酸单元组成，其长度在200 bp以内[6]。由于该标记技术具有分辨率高、多态性高以及对DNA模板要求低等优点，被广泛应用于系统分类、遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究[7]。叶绿体微卫星又称叶绿体SSR（cpSSR），除具有微卫星标记的优点外，还兼有叶绿体基因组结构简单、单亲遗传等特点[8]。随着数据库中叶绿体基因组数据逐步增加，基于cpSSR分子标记分析种群遗传结构的研究较多，如其在三七[Panax notoginseng （Burkill） F. H. Chen ex C. H. Chow][8]、甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill][9]、柑橘属（Citrus）[10]、苦参（Sophora flavescens Aiton）[11]和山药（Dioscorea polystachya Turcz.）[12]等植物研究中均有应用。目前，对于麻叶绣线菊的研究大多集中在生理生化、组织培养和植物资源等方面，如杨建伟等[13]研究表明，麻叶绣线菊生长适宜的土壤水分为田间最大持水量的75%，其净光合速率、气孔导度和蒸腾速率在轻度干旱胁迫下较高。刘正兰等[14]阐述了绣线菊植物组织培养技术流程，可在短期内得到大量试管苗。吴小刚[15]对福建省蔷薇科（木本植物）22属148种进行系统调查发现，该地区蔷薇科植物以灌木为主，乔木、抗性树种较少；在园林绿化方面，常以树林、建筑墙角和山石等景物为背景进行成片绿化。该植物分子水平上的研究相对较少。本研究从GenBank数据库中下载了麻叶绣线菊的叶绿体基因组序列数据和注释文件，根据其序列对叶绿体基因组特征、散在重复序列分布，以及微卫星数量、组成和分布特点进行分析，为该属植物物种的品种鉴定、种质遗传多样性分析及序列引物设计提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从GenBank数据库下载麻叶绣线菊的叶绿体基因组完整序列数据和注释文件（GenBank登录号：OR513068），分别以fasta和gb格式保存。

1.2 试验方法

1.2.1 叶绿体基因组的基因构成分析

将获得的叶绿体完整序列数据进行组装、注释后绘制出叶绿体基因组的基本特征。

1.2.2 叶绿体基因组散在重复序列分析

利用在线工具REPuter（https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer）[16]查找麻叶绣线菊中的散在重复序列，包括正向重复（Forward repeats，F）、反向重复（Reverse repeats，R）、互补重复（Complement repeats，C）和回文重复（Palindromic repeats，P）4种[17]。

1.2.3 叶绿体微卫星分析

使用MISA（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php?action=1）对麻叶绣线菊cpSSR进行识别和定位，设置参数：单碱基重复10次以上，二碱基重复5次以上，三碱基重复4次以上，四碱基、五碱基以及六碱基重复3次以上。统计cpSSR分布区域；基于cpSSR碱基类型，分别统计不同重复类型的微卫星长度和个数，并计算其数量、比例和丰度等信息。

2 结果与分析

2.1 麻叶绣线菊叶绿体基因组特征

麻叶绣线菊叶绿体基因组基本特征如表1所示。其序列长度155 932 bp，是叶绿体基因组典型的四分体结构，即1个大单拷贝区（Large single copy，LSC）、1个小单拷贝区（Small single copy，SSC）和2个长度相同、方向相反的反向重复区（Inverted repeats，IR）。其中，LSC区长度84 363 bp，SSC区长度18 883 bp，两个IR区长度均为26 343 bp。查看注释文件可知，该序列共有132个基因，包括84个mRNA基因、37个tRNA 基因、8个rRNA基因和3个假基因。
表1 麻叶绣线菊叶绿体基因组基本特征
叶绿体基因组基本特征 长度或数量
基因组长度/bp 155 932
大单拷贝区长度/bp 84 363
小单拷贝区长度/bp 18 883
反向重复区长度/bp 26 343
基因总数量/个 132
mRNA基因数量/个 84
tRNA基因数量/个 37
rRNA基因数量/个 8
假基因数量/个 3

2.2 麻叶绣线菊叶绿体基因组散在重复序列分布

麻叶绣线菊叶绿体基因组散在重复序列如表2所示。基于REPuter程序，检测到麻叶绣线菊的叶绿体基因组共有43个散在重复序列，其中正向重复（F）14个，反向重复（R）4个，互补重复（C）1个，回文重复（P）24个，占比分别为32.6％、9.3%、2.3%和55.8％。其中30 bp的序列最多，为12个，且4种类型的重复在该长度中均有分布；其次为31、33和34 bp的序列大小，均有5个，32 bp有4个，其余大小的重复序列均有1～2个（图1）。
表2 麻叶绣线菊叶绿体基因组散在重复序列分布
编号 大小/bp 类型 起始位置

第2次

位置

 错配 E值
1 46 P 10 155 10 155 0 1.38E-18
2 53 P 63 967 63 967 -3 5.33E-17
3 30 P 36 654 46 457 -3 6.50E-04
4 38 P 74 393 74 393 0 9.05E-14
5 30 P 8 339 46 457 0 5.93E-09
6 35 P 10 457 10 457 -3 1.02E-06
7 35 P 52 491 52 503 -3 1.02E-06
8 44 P 29 547 29 547 -2 1.88E-13
9 37 P 10 195 10 195 -3 7.60E-08
10 32 P 52 485 52 485 -2 1.65E-06
11 39 P 44 919 141 192 -1 2.65E-12
12 33 P 107 996 132 235 -1 9.18E-09
13 33 P 108 027 132 266 -1 9.18E-09
14 34 P 91 697 148 546 -2 1.17E-07
15 30 P 110 257 110 257 -2 2.32E-05
16 30 P 130 008 130 008 -2 2.32E-05
17 31 P 96 415 96 415 -3 1.80E-04
18 31 P 143 849 143 849 -3 1.80E-04
19 34 P 91 715 148 564 -2 1.17E-07
20 32 P 128 802 128 802 0 3.71E-10
21 30 P 120 027 120 027 0 5.93E-09
22 34 P 121 791 121 791 -2 1.17E-07
23 31 P 121 542 121 542 -1 1.38E-07
24 40 P 121 378 141 193 0 5.66E-15
25 33 R 13 463 13 463 -2 4.40E-07
26 30 R 66 412 66 412 -2 2.32E-05
27 30 R 145 526 145 526 -2 2.32E-05
28 30 R 94 739 94 739 -2 2.32E-05
29 30 C 94 739 145 526 -2 2.32E-05
30 30 F 45 076 45 102 -3 6.50E-04
31 30 F 9 772 37 714 -3 6.50E-04
32 31 F 8 338 36 653 -3 1.80E-04
33 32 F 52 479 52 506 -3 4.96E-05
34 32 F 37 801 37 833 0 3.71E-10
35 34 F 148 546 148 564 -2 1.17E-07
36 30 F 110 257 130 008 -2 2.32E-05
37 34 F 91 697 91 715 -2 1.17E-07
38 33 F 132 235 132 266 -1 9.18E-09
39 31 F 96 415 143 849 -3 1.80E-04
40 33 F 107 996 108 027 -1 9.18E-09
41 39 F 44 919 99 064 -1 2.65E-12
42 38 F 44 919 121 380 -1 1.03E-11
43 40 F 99 062 121 378 0 5.66E-15
图1 散在重复序列的类型、大小和数量分布

2.3 麻叶绣线菊cpSSR特征

2.3.1 cpSSR位点分布

麻叶绣线菊叶绿体微卫星分布特征如表3所示。使用MISA在线软件在麻叶绣线菊叶绿体基因组中共识别出57个cpSSR位点（不含复合位点），总长662 bp，占总基因组大小的0.42％。cpSSR分布在基因组292～139 898 bp，平均每2 449 bp出现1个cpSSR位点。结果显示，麻叶绣线菊中，cpSSR在LSC区分布最多，其次分布在SSC区，在IR区分布最少。LSC区中，基因间隔区分布最多，其次分别为外显子区和内含子区。SSC区和IR区中，cpSSR均分布在外显子区。
表3 麻叶绣线菊cpSSR分布特征
分布区域 cpSSR位点数量/个 占比/%
LSC 外显子 12 21.05
内含子 4 7.02
基因间隔区 27 47.37
SSC 外显子 8 14.03
内含子 0 0
基因间隔区 0 0
IR 外显子 6 10.53
内含子 0 0
基因间隔区 0 0

2.3.2 cpSSR重复碱基组成与丰度

麻叶绣线菊cpSSR重复碱基组成及丰度等信息如表4所示。碱基组成分析结果表明，单碱基重复基序最多，共45个，占cpSSR总量的78.95％，主要为A/T重复，共44个（97.78%），C/G重复1个（2.22％）。其次为四碱基，有6个，占cpSSR总量的10.53％，其中AATA/TATT和TTTA/TAAA在该类型重复中数量最多，分别有2个（33.33％）。再次为二碱基，有5个，占cpSSR总量的8.77％，为AT/TA和TA/TA重复。最后为五碱基，有1个，占cpSSR总量的1.75％，为CAATT/AATTG重复。未发现三碱基、六碱基及以上碱基重复基序。所有类型的cpSSR重复中，单碱基丰度最高，为282.17个/Mb；最低为单碱基中的C/G、四碱基中的AAAT/ATTT、ATAA/TTAT和五碱基中的CAATT/AATTG，丰度均为6.41个/Mb。
表4 麻叶绣线菊cpSSR重复单元碱基组成及丰度
重复类型 基序 数量/个 比例/% 丰度/（个/Mb）
单碱基 A/T 44 97.78 282.17
C/G 1 2.22 6.41
二碱基 AT/AT 3 60.00 19.24
TA/TA 2 40.00 12.83
四碱基 AAAT/ATTT 1 16.67 6.41
ATAA/TTAT 1 16.67 6.41
AATA/TATT 2 33.33 12.83
TTTA/TAAA 2 33.33 12.83
五碱基 CAATT/AATTG 1 100 6.41

2.3.3 cpSSR长度分布

麻叶绣线菊不同类型的cpSSR长度如图2所示，其平均长度12 bp，最长为19 bp，最短为10 bp，其中长度10 bp的cpSSR数量最多，有25个（43.86％），其次为12 bp，有12个（21.05％），最少为14、16和19 bp，各有1个（1.75％）。
图2 麻叶绣线菊cpSSR长度分布

2.3.4 cpSSR基序拷贝数分布

不同类型重复序列的基序拷贝数分布如图3所示。麻叶绣线菊cpSSR基序的拷贝数在3～19，不同重复类型的基序拷贝数有较大差异。总体来说，基序越长，则拷贝数越少。单碱基重复序列的拷贝数分布范围较广，在10～19，拷贝数为10的重复序列最多，有25个，占重复序列总数的43.86％。其中A重复7个，T重复12个，G重复1个；拷贝数为14、16和19的序列最少，拷贝数为14的序列仅有1个T重复（1.75％），拷贝数为16的序列仅有1个TTTA重复（1.75％），拷贝数为19的序列仅有1个T重复（1.75％）。
图3 不同类型cpSSR重复序列的基序拷贝数分布

3 结论与讨论

本研究使用REPuter在线程序共检测出麻叶绣线菊叶绿体基因组中有43个散在重复序列，其中回文重复最多，正向重复、反向重复次之，互补重复最少。该分布趋势与同属大部分植物相似，如欧亚绣线菊（Spiraea media Schmidt）、土庄绣线菊（Spiraea ouensanensis H. Lév.）[18]、绣球绣线菊（Spiraea blumei G. Don）、三裂绣线菊（Spiraea trilobata L.）、渐尖叶粉花绣线菊（Spiraea japonica var. acuminata Franch.）、珍珠绣线菊（Spiraea thunbergii Siebold ex Blume）和菱叶绣线菊[Spiraea × vanhouttei （Briot） Carrière][19]等。但在同亚科植物紫叶风箱果（Physocarpus opulifolius ‘Purpurea’）中，其数量分布趋势为正向>回文>反向>互补[20]。
使用MISA软件在总长155 932 bp的麻叶绣线菊叶绿体基因组中检测出57个cpSSR。相对于同属其他植物，麻叶绣线菊cpSSR总数较少。原因除物种差异外，可能与查找SSR数量的参数设置有关，如土庄绣线菊中SSR搜索的数量幅度较宽[18]，会影响搜索数量。石汝杰等[21]研究表明，AT含量与基因组中微卫星的分布有关。
麻叶绣线菊cpSSR分布中，主要以单碱基为主，其中以A/T基序最多，本研究中出现的二、四和五碱基重复类型中也以基序A和T最多，C和G重复较少。Borsch等[22]和赵祺等[23]研究表明，与CG相比，AT只有2个氢键连接，更易断裂，在复制过程中可能出现重组、滑脱等不稳定现象，这些现象一定程度上增加了微卫星形成的概率。同时CG的甲基化现象也使GC重复的概率降低[24]。丰富的AT重复在较多物种中大量存在，如紫叶风箱果[20]、蕨麻[Argentina anserina （L.） Rydb.][25]、蒙古韭（Allium mongolicum Regel）[26]和蝴蝶兰（Phalaenopsis aphrodite Rchb. f.）[27]等。
cpSSR的序列长度对其多态性有一定的影响。麻叶绣线菊cpSSR平均长度12 bp，长度为10 bp的重复序列数最多，其次是12 bp，二者共有37个，占比64.91％。长度大于15 bp的有2个，占比3.51％，说明长度越长，丰度越低。这可能与该物种进化过程中的选择压力有关[24，28]。
叶绿体基因组中的微卫星具有稳定、分子量小的优点，且在种内、种间水平均具有高度多态性。因此，常被广泛应用于群体中的遗传学和进化生物学研究。高通量测序技术的不断发展和普及，极大简化了SSR引物开发工作的流程，减少了工作量。
综上，本研究对麻叶绣线菊叶绿体基因组特征、散在重复序列和叶绿体微卫星（cpSSR）序列特征进行分析，结果表明，麻叶绣线菊的叶绿体全基因组序列长度为155 932 bp，是典型的四分体结构；全基因组序列有43个散在重复序列，其中回文重复最多；在其叶绿体全基因组序列上识别出57个cpSSR位点，主要分布于大单拷贝区。cpSSR重复序列共有4种类型，分别为单碱基、二碱基、四碱基和五碱基，其中单碱基重复序列最多，为45个，占重复序列总数的78.95％。cpSSR长度在10～19 bp，其中10 bp最多，占cpSSR总数的43.86％；麻叶绣线菊cpSSR基序的拷贝数在3～19，其中以拷贝数为10的重复序列最多，有25个，占所有重复序列的43.86％。研究结果为微卫星引物开发、分子育种、系统发育及种质资源利用等研究提供参考。

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