烟草根黑腐病是烟草生产中为害较重的土传真菌性病害之一，大多烟区有不同程度的发生，严重地块发病率甚至超过30%[1-3]，造成较大经济损失。烟田套作模式的推广和病原菌的逐年富集，使得烟草病害混合发生率提高。生物防治以其安全绿色、环境友好等优势得到广泛应用。目前已有多种拮抗烟草根黑腐病生防菌的报道。例如，宋玉娟等[1]研究发现，棘孢木霉T-6对烟草促生效果达到75.14%；罗云艳等[2]分离获得了解淀粉芽孢杆菌LY79，其发酵液对感染烟草根黑腐病的盆栽防效达71.54%；易龙等[3]研究发现，木霉菌TB72对烟草根黑腐病的防治效果达84.5%，对病原菌菌丝生长和孢子萌发抑制效果较好。放线菌是原核生物界可以形成分叉菌丝和分生孢子的一类革兰氏阳性菌，被广泛应用于农业、医药、食品、工业和环境治理等领域[3]。目前有关广谱抑制真菌且能有效防治烟草根黑腐病的放线菌报道不多。本研究从烟草根际土壤中筛选由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的烟草根黑腐拮抗菌，对其进行鉴定和抑菌谱测定，并通过盆栽试验验证拮抗菌株的生防效果，为烟草专用菌剂开发及烟草根黑腐病害的田间防治应用提供了基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
采集团棵期至成熟期的健康烟株根际土壤，共10份。烟草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、牡丹黄斑病菌（Phyllosticta commonsii）、牡丹灰霉病菌（Botrytis cinerea）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）、小麦茎基腐病菌（Fusarium pseudograminearum）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）均保存于河南科技大学农学院微生物学实验室。供试烟草品种为云烟87。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株的分离纯化、抑菌谱测定及物种鉴定
（1）菌株筛选。土壤样品阴干后研磨成粉末，采用稀释涂布平板法培养，28 ℃恒温培养6 d，3次重复，观察菌落生长情况，分离菌株纯化后保藏。（2）菌株抑菌谱测定。以烟草根黑腐病菌为指示病原菌，观察并筛选具有抑菌性的目标菌株。在无菌条件下制作烟草根黑腐病菌菌饼，转移至PDA平板中心，菌饼四周接入拮抗菌，28 ℃恒温培养5 d，设置3次重复。观察并测量抑菌圈大小，计算抑菌率[4]。
1.2.2 菌株鉴定
1.2.3 菌株的生物活性测定
参考文献[4]研究方法，测定拮抗菌株的解磷、解钾促生特性，以及产吲哚乙酸（IAA）、解纤维素酶和解淀粉酶的能力。
1.2.4 菌株的盆栽防效验证试验
2 结果与分析
2.1 菌株的筛选及抑菌效果测定
采用稀释涂布法从烟草根际土壤样品中共分离得到32株不同的放线菌，以烟草根黑腐病菌和番茄枯萎病菌等7株病原菌为指示菌，采用平板对峙法，筛选出5株对烟草根黑腐病具有抑制效果的菌株BM-6、BM-7、BM-14、BM-20和BM-25，其中菌株BM-25的抑菌性最好，抑菌圈直径达1.326 cm（图1A~B），抑菌率52.78%。在光学显微镜下观察菌株BM-25的菌丝形态，发现对照菌丝生长均匀，光滑平整，抑制组菌丝分枝增多、部分菌丝膨大变粗（图1C~D）。对菌株BM-25进行进一步的抑菌谱测定，结果表明（图1E~J），该菌株对多种病原真菌均具有一定的抑制效果（图2），说明其抑菌谱较广，开发应用潜力较大。
2.2 目标菌株BM-25的鉴定
2.2.1 形态特征
2.2.2 生化特征
生化试验中，葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、乳糖和甘露醇的测定结果均为阳性；V-P试验结果呈阴性，氧化酶、甲基红测定结果均呈阳性，在含2.5% NaCl环境中生长最好，不抗酸，在pH=8的培养基中生长较好，符合拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）种群特征描述。
2.2.3 16S rRNA特征
2.3 菌株BM-25的生物学活性测定
2.4 菌株BM-25的应用效果验证
表1 菌株BM-25发酵液对烟草农艺性状的影响 |
| 处理 | 株高/cm | 叶数/片 | 茎围/cm | 节距/cm | 最大叶面积/cm2 |
|---|---|---|---|---|---|
| CK | 35.59±2.46 b | 9.00±0.81 c | 2.84±0.24 b | 3.03±0.09 a | 186.27±13.04 c |
| T1 | 62.94±5.97 a | 14.00±0.81 b | 4.55±0.17 a | 2.73±0.11 b | 459.76±22.69 b |
| T2 | 70.79±1.23 a | 21.66±2.49 a | 5.12±0.34 a | 2.63±0.10 b | 705.08±22.94 a |
|
3 结论与讨论
施用生物肥料不仅可以有效提高烟草的产量和品质，且更加环保，有利于促进农业可持续发展。本研究从烟草根际土壤中分离得到32株放线菌，筛选出BM-25菌株，通过试验发现，其对烟草根黑腐病有较好的抑菌效果，抑菌率达52.78%，且具有广谱抑菌性；菌株BM-25具有解磷、解钾，分泌IAA，解淀粉酶和纤维素酶的能力，对烟草株高等农艺性状也有较好的促生作用。经鉴定，BM-25菌株与线团拟诺卡氏菌（Nocardiopsis synnemataformans）具有超99%的序列同源性。拟诺卡氏菌属是一类重要的微生物资源，其种类和功能丰富，被广泛应用于食品、农业和环境保护等领域[10]。近年来在资源开发方面，收集和挖掘天然高盐碱和海洋等极端环境中的拟诺卡氏菌株成为趋势[11-13]。通过生化反应鉴定及防效验证等试验，发现菌株BM-25在碱性环境中生长良好，并对烟草根黑腐病菌具有较好的抑制作用，对烟草植株具有一定促生作用。该菌株的鉴定进一步丰富了烟草根黑腐病菌的生防菌资源库，为该病害的田间防治应用提供了选择。后续试验将尝试对拟诺卡氏菌属的次级代谢产物进行研究，针对其抑菌物质和抑菌机理进行探索。