雪茄烟叶含糖量低、烟碱及总氮含量较高，具有香气馥郁、劲头较大等特点[1]。其不经过烘烤过程，但需要进行充分的发酵和醇化，方可满足雪茄制品的使用要求[2]。发酵前的雪茄烟叶一般色泽不均、香韵单调、协调性差、杂气重和刺激较大[3]，发酵使得糖类、蛋白质等物质进一步降解产生有机酸、挥发性羰基化合物等香气前体物质，化学成分更加趋于协调稳定，感官品质得以改善[4-5]。因此，发酵是影响雪茄烟叶质量的主要因素之一。
雪茄烟叶发酵方式主要有自然发酵和人工干预发酵，关于雪茄发酵技术研究较多。张彤彤等[6]研究发现，贝莱斯芽孢杆菌对雪茄茄衣具有增香提质的作用；时向东等[7]研究表明，雪茄外包皮烟堆积发酵14～21 d时主要中性香气物质含量最高；荣仕宾等[8]以雪茄芯叶为材料，研究温湿度互作对测定样品发酵前后常规化学成分等的影响，发现在发酵温度45～48 ℃、发酵湿度90%、烟叶含水率（30.32±2.16）%条件下，烟叶化学成分协调，香气成分优良；瞿娇娇等[9]研究发现，从豆豉中分离的芽孢杆菌对烟叶品质有明显的改善作用；陈兴等[10]研究发现，从醇化烟叶表面分离筛选到的西姆芽孢杆菌V16菌株可有效改善烟叶内在质量；余玉莎等[11]研究发现，米根霉发酵烟末能增加烟叶部分致香成分。目前，利用生物辅助技术进行云产雪茄烟叶发酵的研究有待进一步深入。本文立足烟叶发酵机制[12-14]，采用9种外源性生物酶制剂和3种微生物进行辅助发酵，利用蒸馏萃取法提取挥发性成分，气相色谱-质谱联用方法（GC-MS）测定其中性致香成分含量，并进行感官质量评价，为云产雪茄烟叶人工干预发酵提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试烟叶为云雪36号，中部二级，产地为云南玉溪元江县。无水硫酸钠（分析纯，四川西陇科学有限公司），乙酸苯乙酯标准品（≥98%，美国Sigma公司）。葡糖淀粉酶（GAL型）（酶活2.6×105 U/mL）、木聚糖酶（XYS型）（酶活2.8×105 U/g）、纤维素酶（酶活1.1×104 U/mL）、氨基肽酶（酶活5 000 U/g）、中性蛋白酶（酶活5.0×104 U/g）、多酚氧化酶（酶活6 000 U/mL）、脂肪酶（酶活1.0×105 U/mL）、半纤维素酶（酶活5.0×104 U/mL）和果胶酶（酶活6.0×104 U/mL）均购于夏盛酶生物技术有限公司。短小芽胞杆菌（CICC 9014）、巨大芽胞杆菌（CICC 9013）和恶臭假单胞菌（NBRC 14164）均购于北京保藏生物科技有限公司。
1.2 试验仪器与试剂
R-220SE旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司），Milli-Q Element型超纯水仪（美国Millipore公司），BSA224S-CW电子天平（德国Sartorius公司），7890A/5975C气质联用仪（美国Agilent公司）；二氯甲烷（分析纯，四川西陇科学有限公司）；培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（BF）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，灭菌条件121 ℃，1.05 kg/cm2，22 min。
1.3 试验设计
1.3.1 烟叶预处理
取相同品种、等级和晾制水平的雪茄烟叶，采取半叶法[15]进行预处理，烟叶样品切丝并平衡水分至13%备用。
1.3.2 酶制剂及微生物处理
称取各种酶制剂1.0 g，分别使用无菌水溶解并定容至100.0 mL容量瓶中，用无菌小型喷雾器将制备好的酶液均匀喷淋在烟丝样品上，各处理称取300 g，喷施量0.1 mL/g；对照用无菌水处理，混匀后装入自封袋备用。将短小芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌和恶臭假单胞菌分别接种于BF斜面，28 ℃恒温培养，活化2 d后，在各试管中倒入10 mL无菌水将菌苔洗下，将细胞浓度调至108 CFU/mL。以悬浮液1/100的量接种到300 mL液体培养基中，在30 ℃摇床150 r/min培养2 d，将菌悬液于4 ℃、11 000 r/min离心10 min，保留湿菌体，利用30 mL无菌水将其重悬，得到制备好的菌液，后续与酶液处理烟丝样品一致。将上述各处理样品置于40 ℃、相对湿度70%的恒温恒湿箱中进行人工发酵，发酵时间72 h后，置于90 ℃干燥箱中10 min，使酶和微生物在高温条件下失活。各处理组分别为对照（CK）、葡糖淀粉酶（GAL型）处理（A1）、木聚糖酶（XYS型）处理（A2）、纤维素酶处理（A3）、氨基肽酶处理（A4）、中性蛋白酶处理（A5）、多酚氧化酶处理（A6）、脂肪酶处理（A7）、半纤维素酶处理（A8）、果胶酶处理（A9）、短小芽胞杆菌（CICC 9014）处理（B1）、巨大芽胞杆菌（CICC 9013）处理（B2）和恶臭假单胞菌（NBRC 14164）处理（B3）。
1.4 测定指标与方法
1.4.1 GC-MS检测香气物质含量变化
精密称量雪茄烟叶绝干质量15.00 g的烟叶样品进行提取，以乙酸苯乙酯为内标，内标溶液配制以及蒸馏萃取方法参考文献[16]。色谱柱，HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度，250 ℃；程序升温，初始温度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；载气，氦气；流速，1.0 mL/min；进样方式，分流进样；分流比，10∶1；进样体积，1 μL；离子源，EI；电离能，70 eV；离子源温度，230 ℃；传输线温度，260 ℃；检测模式：全离子扫描监测；质量扫描范围，33～550 amu；溶剂延迟，3.5 min。根据NIST11谱库检索，挥发性化合物取正、反匹配度≥800的鉴定结果，GC-MS相对定量法参考文献[16]，最终组分含量单位换算为μg/g。
1.4.2 感官质量评价
各处理样品在相对湿度（60±2）%、温度（22±1）℃ 环境下平衡48 h，参考YC/T 138—1998《烟草及烟草制品 感官评价方法》[17]，采用相同烟管卷制，由专业评吸人员进行感官质量评价。
2 结果与分析
2.1 生物辅助发酵烟叶中性致香成分含量变化
表1 生物辅助发酵云产雪茄烟叶的主要中性致香成分含量 (μg/g) |
| 致香成分 | 处理 | |||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9 | B1 | B2 | B3 | ||
| 合计 | 236.79 | 226.95 | 291.88 | 216.63 | 226.27 | 254.79 | 227.00 | 209.80 | 231.95 | 220.62 | 172.76 | 216.79 | 219.57 | |
| 苯丙氨酸转化产物 | 苯甲醛 | 1.39 | 1.24 | 1.18 | 0.95 | 1.00 | 1.12 | 1.00 | 1.29 | 0.80 | 1.04 | 0.87 | 1.06 | 0.77 |
| 苯甲醇 | 1.97 | 2.19 | 5.53 | 5.70 | 4.18 | 3.89 | 3.64 | 3.57 | 4.03 | 3.82 | 1.98 | 3.27 | 1.97 | |
| 苯乙醛 | 5.01 | 4.64 | 5.72 | 14.48 | 16.89 | 12.95 | 26.79 | 27.02 | 25.56 | 24.68 | 22.82 | 28.19 | 23.54 | |
| 苯乙醇 | 19.04 | 9.19 | 9.49 | 5.74 | 13.85 | 17.49 | 12.92 | 13.56 | 15.32 | 13.89 | — | 13.06 | 5.10 | |
| 小计 | 27.41 | 17.26 | 21.92 | 26.87 | 35.92 | 35.45 | 44.35 | 45.44 | 45.71 | 43.43 | 25.67 | 45.58 | 31.38 | |
| 非酶棕色化反应产物 | 糠醛 | 1.04 | — | 1.77 | 1.48 | 0.94 | 1.69 | — | — | — | 0.87 | 0.78 | — | — |
| 糠醇 | 5.93 | 8.36 | 3.73 | 4.17 | 3.64 | 6.22 | 4.65 | 1.32 | 2.87 | 3.61 | 2.24 | 2.64 | 3.14 | |
| 小计 | 6.97 | 8.36 | 5.50 | 5.65 | 4.58 | 7.91 | 4.65 | 1.32 | 2.87 | 4.48 | 3.02 | 2.64 | 3.14 | |
| 西柏烷类降解产物 | 茄酮 | 11.55 | 14.86 | 16.93 | 14.99 | 15.36 | 15.10 | 17.85 | 18.13 | 16.65 | 17.74 | 13.68 | 16.38 | 18.28 |
| 类胡萝卜素降解产物 | 芳樟醇 | — | — | — | 0.57 | — | 0.69 | 0.69 | 0.63 | 0.72 | 0.70 | 0.53 | — | 0.43 |
| 4-氧代异佛尔酮 | 0.51 | 0.62 | 0.41 | 0.46 | 0.64 | 0.55 | 0.46 | 0.49 | 0.36 | — | 12.20 | — | 0.38 | |
| 突厥烯酮 | — | 6.68 | — | 5.80 | 6.19 | 6.77 | — | — | — | — | — | — | — | |
| 大马士酮 | 7.22 | — | 8.59 | — | 2.00 | 2.60 | 7.72 | 8.56 | 7.92 | 7.39 | 5.96 | 7.95 | 7.45 | |
| 香叶基丙酮 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 0.84 | 0.99 | 1.18 | 1.04 | |
| 4-羟基-β-二氢大马酮 | 2.68 | 2.33 | 2.76 | 2.07 | 1.44 | 2.85 | — | — | — | — | — | — | — | |
| 巨豆三烯酮（1-4） | 58.50 | 53.72 | 58.97 | 43.62 | 44.84 | 52.79 | 63.20 | 54.99 | 62.70 | 57.51 | 43.90 | 57.04 | 56.05 | |
| 9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮 | 11.23 | 9.17 | 10.84 | 3.97 | 3.44 | 9.99 | — | — | 1.08 | 1.09 | 0.98 | — | 1.23 | |
| 小计 | 80.14 | 72.52 | 81.57 | 56.49 | 58.55 | 76.24 | 72.07 | 64.67 | 72.78 | 67.53 | 64.56 | 66.17 | 66.58 | |
| 叶绿素降解产物 | 新植二烯 | 40.58 | 40.90 | 57.49 | 47.28 | 57.57 | 40.47 | 46.19 | 41.58 | 45.79 | 53.00 | 37.85 | 45.43 | 48.57 |
| 其他 | 阿托醛 | 13.04 | 12.14 | 10.19 | 4.85 | 3.51 | 8.20 | — | — | — | — | — | — | — |
| 2-甲氧基-4-乙烯苯酚 | — | — | — | — | — | — | 1.62 | 1.69 | 1.79 | 1.84 | 1.81 | 1.44 | 2.13 | |
| 3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛 | 4.07 | 3.76 | 3.03 | 3.72 | 3.44 | 4.21 | 1.64 | 1.64 | 1.36 | 1.25 | 1.07 | 1.06 | 0.69 | |
| 十五醛 | — | — | — | — | — | — | — | 1.16 | — | 1.00 | — | 0.97 | — | |
| 植酮 | — | — | — | — | — | — | — | — | — | 0.61 | 0.53 | 0.56 | 0.54 | |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | — | — | — | — | — | — | — | 0.61 | — | 1.24 | 0.66 | 0.80 | 0.99 | |
| 棕榈酸甲酯 | — | — | — | — | — | — | — | 0.73 | — | 1.01 | 0.53 | 0.49 | 0.64 | |
| （1R，2E，4S，7E，11E）-4-异丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-环十四烷并三烯-1-醇 | — | — | — | — | — | — | 2.64 | 4.74 | 5.41 | 1.79 | — | — | 3.55 | |
| （2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-环十四碳三烯-1，13-二醇 | 39.24 | 34.04 | 49.27 | 34.71 | 22.47 | 40.37 | 16.15 | 12.79 | 17.72 | 18.35 | 16.20 | 13.60 | 17.42 | |
| 叶绿醇 | — | 11.07 | 26.19 | 9.15 | 14.60 | 13.67 | 11.00 | 13.34 | 14.86 | — | — | 14.68 | 16.47 | |
| 香紫苏醇 | 5.96 | 5.31 | 9.10 | 7.63 | 5.64 | 6.20 | 5.16 | — | 3.65 | 4.26 | 4.02 | 3.75 | 5.38 | |
| 正二十七烷 | 7.83 | 6.73 | 10.69 | 5.29 | 4.63 | 6.97 | 3.68 | 1.96 | 3.36 | 3.09 | 3.16 | 3.24 | 3.81 | |
| 小计 | 70.14 | 73.05 | 108.47 | 65.35 | 54.29 | 79.62 | 41.89 | 38.66 | 48.15 | 34.44 | 27.98 | 40.59 | 51.62 | |
|
2.1.1 苯丙氨酸转化产物
由图1可知，除A1、A2、A3和B1外，其余处理烟叶苯丙氨酸转化产物含量均高于CK，其中A8较CK增加66.76%，B2较CK增加66.29%。各处理样品中，苯甲醛含量相对差异较小，其余组分含量差异较大，B2烟叶的苯乙醛含量最高，为28.19 μg/g，B1未检测到苯乙醇。说明生物辅助发酵有利于苯丙氨酸转化产物的积累。
2.1.2 非酶棕色化反应产物
A1烟叶的非酶棕色化反应产物含量最高，较CK增加19.94%，A5次之，较CK增加13.49%，其余处理均低于CK；各样品中均检测到糠醇，仅在CK、A2、A3、A4、A5、A9和B1样品中检测到糠醛，各处理对非酶棕色化反应产物积累存在差异（图2）。
2.1.3 西柏烷类降解产物
由图3可知，各处理样品中均检测到茄酮，且含量均高于CK，其中B3烟叶的茄酮含量最高，为18.28 μg/g，较CK增加58.27%。整体上看，生物辅助发酵有利于西柏烷类降解产物的积累，以B3茄酮含量最高。
2.1.4 类胡萝卜素降解产物
由图4可知，A2的类胡萝卜素降解产物含量最高，为81.57 μg/g，其余处理样品均低于CK。其中，A5的突厥烯酮和4-羟基-β-二氢大马酮含量均最高，分别为6.77和2.85 μg/g；B2的香叶基丙酮含量较高，为1.18 μg/g；A2的大马士酮含量较高，为8.59 μg/g；B1的4-氧代异佛尔酮含量较高（12.20 μg/g）。整体上看，生物辅助发酵不利于类胡萝卜素降解产物的积累。
2.1.5 叶绿素降解产物和其他物质
由表1可知，各处理样品中均检测到叶绿素降解产物新植二烯，除A5和B1外，其余处理样品新植二烯含量均高于CK，以A4含量最高，为57.57 μg/g；其他中性致香成分中，各样品均检测出的共性中性成分物质为3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛、（2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-环十四碳三烯-1，13-二醇和正二十七烷，产生的各类挥发性成分将直接或间接影响雪茄的感官质量。
2.2 生物辅助发酵的云产雪茄感官质量评价
由表2可知，9种酶制剂处理样品中，除A4和A7感官质量评分低于CK外，其余处理样品评分均高于CK；3种微生物处理样评分均高于CK，以B2样品评分较高，为86.5分，与CK相比，主要表现在烟气质感和香韵丰富性有所提升，杂气、刺激和余味均有改善，口腔回甜感较好。A3综合评分略低于A5，但总体品质较CK有较大提升，主要表现在烟气细腻、香气丰富且浑厚、刺激性降低及余味改善。与CK相比，A4雪茄样品有颗粒感、刺激较明显及舒适感降低；A7烟气质感和协调性略有下降，枯焦杂气较明显。整体上看，除A4和A7外，其余处理样品分别在香气、协调、杂气和刺激性等方面较CK具有一定提升作用。
表2 各处理的雪茄样品感官质量评价 (分) |
| 处理 | 光泽 | 香气 | 谐调 | 杂气 | 刺激性 | 余味 | 合计 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 5.0 | 29.0 | 4.5 | 12.0 | 11.0 | 11.0 | 72.5 |
| A1 | 5.0 | 30.0 | 5.0 | 13.0 | 12.0 | 13.0 | 78.0 |
| A2 | 5.0 | 30.0 | 4.5 | 12.0 | 11.0 | 11.0 | 73.5 |
| A3 | 5.0 | 31.0 | 5.0 | 13.0 | 12.0 | 14.0 | 80.0 |
| A4 | 5.0 | 29.0 | 4.5 | 12.0 | 10.0 | 11.0 | 71.5 |
| A5 | 5.0 | 32.0 | 5.5 | 14.0 | 14.0 | 13.0 | 83.5 |
| A6 | 5.0 | 31.0 | 5.0 | 13.0 | 11.0 | 12.0 | 77.0 |
| A7 | 5.0 | 28.0 | 4.0 | 11.0 | 12.0 | 11.0 | 71.0 |
| A8 | 5.0 | 30.0 | 4.5 | 13.0 | 12.0 | 10.0 | 74.5 |
| A9 | 5.0 | 30.0 | 5.0 | 12.0 | 11.0 | 11.0 | 74.0 |
| B1 | 5.0 | 29.0 | 4.5 | 13.0 | 13.0 | 10.0 | 74.5 |
| B2 | 5.0 | 33.0 | 5.5 | 15.0 | 15.0 | 13.0 | 86.5 |
| B3 | 5.0 | 30.0 | 5.0 | 12.0 | 12.0 | 11.0 | 75.0 |
3 讨论
3.1 生物辅助发酵对中性致香成分的影响
本研究表明，大部分生物辅助发酵处理样品的苯丙氨酸转化产物高于CK，说明生物辅助发酵有利于苯丙氨酸转化产物的积累。生物辅助发酵过程中，苯丙氨酸各单体成分可相互转化，苯丙氨酸通过Streker降解反应形成苯乙醛，进一步氧化形成苯乙醇，经脱氨形成肉桂酸，后形成苯甲醛，苯甲醛可氧化形成苯甲醇[19]。苯乙醛具有强烈的花香、皂香，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香韵，苯甲醇可提供烟叶弱花香，而B2的苯乙醛含量最高，对其香韵丰富性提升具有促进作用；B1未检测到苯乙醇，可能与其进一步氧化成苯甲醛有关。
非酶棕色化反应产物含量与烟叶感官质量密切相关[20]。A1非酶棕色化反应产物含量较CK明显提升，可能是葡糖淀粉酶将烟叶淀粉等物质的非还原糖末端α-1-4葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖；或者缓慢水解α-1-6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。A5非酶棕色化反应产物含量较CK提升也较明显，可能是中性蛋白酶将多肽的游离羧基末端或游离氨基末端的肽链逐一水解生成氨基酸，增加了反应底物。苏宇等[21]研究表明，美拉德反应物烟叶还原糖含量与香气量、透发性、杂气以及干燥感呈极显著正相关，脯氨酸含量与烟气透发性、杂气和刺激性呈显著或极显著正相关。糠醇可赋予样品谷香、油香，具有一定的苦辣气味，糠醛有杏仁气味，部分处理样品未检测到糠醛，可能与其进一步氧化代谢有关。
茄酮是烟草中西柏烷类降解产物的代表，也是烟草中含量较为丰富的中性香味成分之一，其转化产物茄醇、茄尼呋喃和降茄二酮均是重要的烟草香味物质。茄酮本身具有香气，可增加烟草香韵，改善烟气质感。各处理样品中茄酮均高于CK，说明生物辅助发酵有利于提升烟叶质量。
类胡萝卜素是烟草中重要的萜烯类化合物之一，烟草中性致香成分中，大部分化合物为类胡萝卜素降解产物，烟叶发酵过程中，类胡萝卜素持续降解。本研究发现，与CK相比，A2类胡萝卜素降解产物含量提高；A5突厥烯酮和4-羟基-β-二氢大马酮含量提升明显，突厥烯酮具有强烈的花香、果香，可提升烟叶的感官质量；B2香叶基丙酮含量较高，有利于提升烟叶香韵丰富性和改善烟草质感。说明生物辅助发酵不利于类胡萝卜素降解产物的积累，但有利于提升烟叶香韵和感官质量。
新植二烯在各处理样品单体物质中属于含量较高的化合物之一，这与时向东等[7]研究结果一致。新植二烯是烟叶中重要的非色素类萜烯，能增进烟叶的香气和口感，刺激较小，部分生物辅助发酵的新植二烯含量高于CK，说明生物辅助发酵有利于促进新植二烯含量的积累，提升烟叶的口感和香气。
3.2 生物辅助发酵对云产雪茄感官质量的影响
生物辅助发酵的各处理样品中，除A4和A7感官质量评分较CK略有下降，其余处理综合评分均高于CK，以A5和B2感官评分较高，较CK分别提升15.17%和19.31%；A5感官评分较高，可能是中性蛋白酶促进烟叶蛋白质降解及转化，避免蛋白质含量过高时产生难闻的气味，以及形成苦、涩、辛辣等不良口感；同时与对烟气质量具有正向提升作用的苯乙醇、突厥烯酮和4-羟基-β-二氢大马酮含量较高也有关。B2香韵的优雅感和丰富性提升较明显，与苯乙醛、大马士酮和香叶基丙酮等含量较高有关。
4 结论
（1）本试验利用外源性的9种生物酶制剂及3种微生物辅助云产雪茄烟叶发酵，通过GC-MS分析发现，生物辅助发酵处理有利于苯丙氨酸降解产物、西柏烷类降解产物和叶绿素降解产物的积累，不利于类胡萝卜素降解产物的积累。各类型香气成分同烟叶感官质量密切相关，部分成分含量虽较低，却对其感官质量产生较大影响，可能与感官阈值有关。
（2）除氨基肽酶、脂肪酶处理后的烟叶感官评分略有下降，其余生物酶辅助处理综合评分均高于CK，说明外源性生物酶制剂和微生物辅助发酵均有利于烟叶感官质量的提升。酶作为特殊蛋白质可直接参与烟叶发酵过程香气前体物质的降解及转化，也可起到催化发酵的作用，间接影响烟叶发酵进程；烟叶发酵过程中，微生物生长繁殖将消耗烟叶中的大分子物质，如蛋白质、纤维素及淀粉等，可改善烟草香气与口感；部分微生物代谢产物本身是香气物质，或对烟叶化学成分变化起催化作用，间接促进大分子物质的分解、转化和增香化合物的产生。
本研究分析了外源性生物酶制剂、微生物等生物技术辅助云产雪茄烟叶发酵过程中各类型香气前体物质及感官质量变化情况，为云产雪茄烟叶人工干预生物辅助发酵及规模化生产提供参考。