蓝莓是杜鹃花科越橘属落叶丛生灌木植物，在我国主要分布于东北、西南和华南等地[1]。蓝莓果实果肉细腻，富含维生素、花青素和多酚类化合物等物质，同时具有改善视力、增强免疫力等功效[2]，可作为鲜食水果，也适合用于生产加工。由于蓝莓果实质地柔软且含水量较高，不易贮存[3]，可经加工制成蓝莓汁、蓝莓果酱和蓝莓果酒等易于贮存和运输的产品。
蓝莓果酒是以蓝莓为原料，经酵母菌发酵而成的一种酒精饮料，酒精含量较低，口感风味俱佳。酵母菌尤其是野生酵母具有来源广泛、种类丰富和代谢途径多样等特点，一定程度上影响发酵果酒的营养品质与风味[4]。蓝莓果酒可通过自然发酵或人工添加酵母等方式发酵，目前用于蓝莓果酒酿造的酵母菌多为商用酿酒酵母。盖禹含等[5]研究发现，不同酵母发酵的蓝莓酒含有相同的香气成分；严红光等[6]利用气相色谱离子迁移谱技术在蓝莓样酒中检出35种风味物质成分，利用气质联用技术检出15种成分；阳志锐等[7]研究指出，异常威克汉姆酵母和葡萄酒酿酒酵母混合发酵的蓝莓酒DPPH和ABTS自由基清除率均较高；李丹等[8]从蓝莓中分离筛选出1株产酒性能优良、产品感官评分较高的菌株，经鉴定将其命名为粟酒裂殖酵母Y201505（Schizosaccharomyces pombe Y201505）；伍鹤等[9]从蓝莓成熟果实、叶片及果园土壤中筛选得到最优菌株BBF-17，经鉴定其为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。关于野生酵母发酵的研究有待进一步探讨，本研究利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法和杜氏小管发酵法对蓝莓果实表面的酵母菌进行筛选，对确定进行后续试验的菌株进行分子生物学鉴定以及生长曲线测定，同时从培养温度、初始pH等方面对其发酵性能进行研究，为筛选蓝莓果酒发酵专用酵母提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料和试验试剂
蓝莓果实采集自贵州省麻江县宣威镇生态蓝莓种植基地。YPD培养基和TTC上层培养基参照佀胜利等[10]的方法进行配制。葡萄糖（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；TTC（分析纯），福晨（天津）化学试剂有限公司；乙醇和硫酸（分析纯），成都金山化学试剂有限公司；酵母浸粉、蛋白胨和琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器设备
MJ-150-I霉菌培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；SHZ-82气路恒压振荡器，邦西仪器科技（上海）有限公司；V-1100D可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；LC20液相色谱仪和RID-20A示差折光检测器，岛津企业（中国）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 酵母菌的分离纯化
称取5 g蓝莓果实，将其置于装有45 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃、150 r/min条件下振荡培养24 h，得到蓝莓果实表面微生物悬液。用无菌水将菌悬液梯度稀释至10-6浓度，分别取10-4、10-5和10-6 浓度100 μL稀释液涂布在YPD平板上，28 ℃培养24 h，挑选菌落形态与酵母菌较为一致的单菌落，经多次转接纯化后，将菌株编号保存备用。
1.3.2 酵母菌的筛选
（1）初筛：将纯化得到的菌株接种在YPD平板，培养24 h后在平板上缓慢倾倒一层2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）培养基，之后置于28 ℃下遮光培养3 h，观察菌落颜色变化。酵母菌株产酒精能力越强，菌落颜色越红，选取红色较深的菌株进行复筛。（2）复筛：取初筛得到的酵母菌株，用牙签接种至装有杜氏小管的YPD液体培养基中，28 ℃下静置培养，间隔一段时间观察杜氏小管内的气体积存量。48 h后取发酵液在4 000 r/min转速下离心10 min，用微孔滤膜过滤上清液，利用高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液中葡萄糖和乙醇浓度。选取发酵液产气较快、葡萄糖含量较低且乙醇含量较高的菌株进行后续试验。采用HPLC测定各菌株发酵液中葡萄糖和乙醇含量，液相色谱条件：色谱柱为Shedox Sugar SH1011（8 mm×300 mm），流动相为5 mmol/L H2SO4，洗脱方式为等梯度洗脱，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，柱温65 ℃，检测器为示差折光检测器。
1.3.3 酵母菌的分子生物学鉴定
将筛选得到的酵母菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司，以引物NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）进行26S rDNA D1/D2区的扩增，并对PCR产物进行纯化和测序，得到PCR扩增片段的原始序列。根据测序结果，利用BLAST软件从GenBank核酸序列数据库中进行同源序列比对，利用MEGA X软件选取相似度较高的酵母菌株核酸序列进行多序列对位排列，并构建系统发育树。
1.3.4 酵母菌的生长曲线测定
将复筛得到的菌株接种于YPD液体培养基，28 ℃、150 r/min振荡培养12 h，得到种子培养基。将种子培养基按5%接种量接种到新的YPD培养基中，28℃、150 r/min振荡培养，在发酵0、2、4、8、12、24和48 h后分别取培养液，以未接种YPD培养基为对照，测定各培养液在600 nm处的吸光值，以取样时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制酵母菌生长曲线。每个试验设3次重复。
1.3.5 酵母菌的发酵性能研究
（1）培养温度对酵母菌生长的影响：以5%接种量将种子培养基接种于YPD培养基中，分别在23、28、33、38和43 ℃条件下静置培养48 h，培养结束后，测定各培养液在600 nm处的吸光度值。每个试验设3次重复。（2）初始pH对酵母菌生长的影响：利用1% HCl调节YPD培养基pH至2、3、4、5和6，按照5%接种量接种种子培养基，28 ℃下静置培养48 h，培养结束后，测定培养液在600 nm处的吸光度值。每个试验设3次重复。（3）酵母菌的糖耐受性试验：配制葡萄糖浓度分别为100、150、200、250和300 g/L的YPD液体培养基，后续操作与初始pH对酵母菌生长的影响试验一致。（4）酵母菌的乙醇耐受性试验：在YPD培养基中加入不同体积无水乙醇，将乙醇浓度（v/v）设定为3%、6%、9%和12%，后续操作与初始pH对酵母菌生长的影响试验一致。（5）酵母菌的二氧化硫（SO2）耐受性试验：在YPD培养基中加入不同质量的焦亚硫酸钾，将SO2浓度设定为100、150、200和250 mg/L，后续操作与初始pH对酵母菌生长的影响试验一致。
1.4 数据处理
使用Excel软件进行数据处理，并使用Origin进行绘图。
2 结果与分析
2.1 野生酵母菌的筛选
经过增殖培养、分离纯化，从蓝莓果实表面共分离得到16株菌落形态类似酵母菌的菌株，编号ZL01～ZL16。16个菌株的显色情况如表1所示，共得到深红色菌株2株、红色菌株3株、浅红色菌株3株以及颜色不明显菌株8株。
表1 蓝莓果实野生酵母TTC显色情况 |
| TTC显色情况 | 菌株数量/株 | 菌株编号 |
|---|---|---|
| 深红色 | 2 | ZL01和ZL14 |
| 红色 | 3 | ZL13、ZL15和ZL16 |
| 浅红色 | 3 | ZL04、ZL07和ZL10 |
| 颜色不明显 | 8 | ZL02、ZL03、ZL05、ZL06、ZL08、ZL09、ZL11和ZL12 |
选择TTC显色为深红色和红色的5株菌株（ZL01、ZL13、ZL14、ZL15和ZL16）进行复筛，发酵过程中，5株菌株发酵液的杜氏小管均能在发酵18 h内充满气体。发酵结束后，对发酵液中的葡萄糖和乙醇含量进行测定，结果如图1所示。其中，ZL01发酵液中的乙醇含量最高，葡萄糖含量最低，选择该菌株进行后续试验。
2.2 菌株ZL01的分子生物学鉴定
根据菌株ZL01的26S rDNA D1/D2区测序结果在NCBI数据库中的比对信息，该菌株与葡萄有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）相似性在99%以上，选取有孢汉逊酵母属相关菌株与ZL01进行系统发育树构建，如图2所示。ZL01与葡萄有孢汉逊酵母相似性达99%，因此确定ZL01为葡萄有孢汉逊酵母。
2.3 酵母菌株ZL01的生长曲线
将菌株ZL01振荡培养48 h，定期测定培养液的吸光度值，以取样时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制生长曲线，如图3所示。发酵0～2 h，菌体数量增长缓慢，此阶段为菌株ZL01的迟缓期；发酵2～8 h，菌体数量快速增加，为对数生长期；8～48 h菌体增长速度减缓并趋于稳定，为稳定期。
2.4 菌体ZL01的发酵性能
2.4.1 培养温度
菌株ZL01在不同温度下培养48 h，培养结束后测定各菌液在600 nm处的吸光度值，结果如图4所示。随着培养温度的升高，培养液的OD600值呈先升高后降低的趋势，在28 ℃时达到最高值，说明菌株ZL01的最适培养温度为28 ℃；培养温度为38 ℃时，将该温度条件下的培养液涂布于YPD平板上，培养24 h有菌落生成。说明菌株ZL01能在38℃下生长，28 ℃下菌液浓度较高。
2.4.2 初始pH
将菌株ZL01放在不同初始pH的YPD培养基中培养48 h，培养结束后测定菌液在600 nm处的吸光度值，结果如图5所示。随着pH的增加，培养液的OD600值逐渐升高，在pH 5时达到最大值，pH 6时略有降低，说明pH 5接近菌株ZL01的最适生长环境。将初始pH 2的培养液涂布于YPD平板，24 h后有少量单菌落生成。说明菌株ZL01可在初始pH 2的环境下生长，在初始pH 5的环境下生长较旺盛。
2.4.3 菌株ZL01的糖耐受性
将菌株ZL01接种到含有不同浓度葡萄糖的YPD培养基中，培养48 h后测定菌液在600 nm处的吸光度值，结果如图6所示。随着葡萄糖浓度的增加，培养液的OD600值呈下降趋势，其中葡萄糖浓度由100 g/L升高至150 g/L时，培养液的OD600值下降速度较快，葡萄糖浓度从200 g/L升高至250 g/L时，培养液吸光度值基本无变化。将250 g/L葡萄糖浓度培养液涂布于YPD平板上，24 h后有菌落生成，说明菌株ZL01能够耐受250 g/L葡萄糖。
2.4.4 菌株ZL01的乙醇耐受性
将菌株ZL01接种到含有不同浓度乙醇的YPD培养基中，培养48 h后测定菌液在600 nm处的吸光度值，结果如图7所示。随着乙醇浓度的增加，培养液的OD600值呈下降趋势。将乙醇浓度9%和12%的培养液涂布于YPD平板上，24 h后含9%乙醇培养液涂布的平板有少量菌落生成，而含12%乙醇培养液涂布的平板无菌落生长。说明菌株ZL01不能在12%乙醇溶液中生长，其最大耐受乙醇浓度接近9%。
2.4.5 菌株ZL01的SO2耐受性
3 结论与讨论
为筛选出适用于蓝莓果酒发酵的微生物菌株，本研究通过分离纯化、两级筛选、生物学鉴定、生长曲线绘制和发酵性能评价，从蓝莓果实表面得到可用于蓝莓果酒发酵的潜在酵母菌株1株，经鉴定为葡萄有孢汉逊酵母。该菌株的最佳生长温度28 ℃，最佳生长pH 5，能耐受23 ℃低温、38 ℃高温、pH 2、250 g/L葡萄糖、9%乙醇和250 mg/L SO2。
葡萄有孢汉逊酵母是一种常用于果酒发酵的非酿酒酵母，在产β-葡萄糖苷酶和果酒增香上较酿酒酵母更有优势[11-12]。冯文倩等[13]从葡萄筛选获取了4株有孢汉逊酵母菌株，发现其耐受400 g/L糖、300 mg/L SO2、pH 2.8、10 ℃低温、40 ℃高温；刘晓柱等[14]从刺梨中分离得到1株葡萄有孢汉逊酵母，该菌株具有较好的柠檬酸耐受性，耐受300 mg/L SO2。本试验与以上结果存在差异，可能与试验设置的浓度梯度不一致有关。Li等[15]研究发现，从蓝莓果实上分离到的葡萄有孢汉逊酵母对蓝莓采后病害有较好的生防作用；Huang等[16]利用酿酒酵母和从刺梨中分离得到的葡萄有孢汉逊酵母对蓝莓等水果进行混合发酵果酒，发现混合发酵可提高果酒香气成分的复杂性，并赋予其独特风味，同时该蓝莓果酒在香气物质的种类和含量上均优于其他两种果酒。本试验暂未测定该野生酵母菌株酿造的果酒风味物质等含量，后续可聚焦此方面开展研究。