雪茄香气馥郁、风味独特，其烟叶需经过发酵、醇化等特殊环节，才能满足雪茄制品配方应用需求，而微生物在发酵过程中扮演着重要角色[1-2]。因此，研究不同部位雪茄烟叶品质与微生物菌落特征具有重要意义。目前，相关学者聚焦海拔高度对烤烟烟叶感官品质及化学成分的影响[3-4]以及烟草内源、外源性微生物影响烟叶发酵品质的机制[5]等方面。吴丽君等[6]研究表明，云南雪茄烟叶人工发酵过程中化学成分与细菌菌落变化相互影响。张碰元等[7]分析了醇化方式对津巴布韦烟叶微生物和香味成分的影响，发现醇化时间和醇化库对菌落的相对丰度具有一定影响。胡婉蓉等[8]研究发现，添加发酵介质会影响雪茄烟叶非挥发性有机酸总质量分数的变化，有利于改善其感官质量。赵铭钦等[9]研究表明，生物制剂处理后的发酵烟叶中，大马酮、二氢大马酮和巨豆三烯酮等香气成分含量增加。余玉莎等[10]研究发现，米根霉（Rhizopus oryzae）能增加烟叶部分致香成分。陈兴等[11]证明了从醇化烟叶表面分离筛选到的西姆芽孢杆菌（Bacillus siamensis）能有效改善烟叶内在质量。结合云产雪茄烟叶不同部位的感官品质、挥发性成分及微生物菌落特征机制的研究鲜少报道。本试验以雪茄茄芯品种云雪39号为研究对象，探索其不同部位雪茄烟叶的感官品质、中性致香成分含量及微生物菌落特征，为雪茄烟叶配方开发及功能性微生物筛选提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试烟叶：云雪39号（上部二级叶C1、中部二级叶C2和下部二级叶C3），采自云南玉溪元江县甘庄街道撮科收费站旁，海拔720.9 m，102.172° E，23.778° N。
1.2 试剂与仪器
主要试剂：二氯甲烷（分析纯，四川西陇科学有限公司）；无水硫酸钠（分析纯，四川西陇科学有限公司）；乙酸苯乙酯标准品（≥98%，美国Sigma公司）。主要仪器：R-220SE旋转蒸发仪（瑞士Büchi公司）；Milli-Q Element型超纯水仪（美国Millipore公司）；BSA224S-CW电子天平（德国Sartorius公司）；7890A/5975C气质联用仪（美国Agilent公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 样品处理及感官质量评价
以不同部位雪茄烟叶为单一变量，统一采收后经雪茄烟晾房相同工艺完成晾制；将晾制好的样品在相对湿度（60±2）%、温度（22±1）℃环境下平衡48 h后，采用相同烟管卷制，由专业评吸人员参考YC/T 138—1998《烟草及烟草制品 感官评价方法》[12]进行感官质量评价。
1.3.2 中性致香成分测定
精密称量雪茄烟叶样品绝干质量12.500 g，参考郑建宇等[13]的试验方法，以乙酸苯乙酯为内标，使用蒸馏萃取（SDE）方法提取挥发性成分，并通过气相色谱质谱法（GC-MS）进行分析。
1.3.3 微生物多样性与群落结构
样品的微生物扩增子测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成，使用799F（AACMGGATTAGATACCCKG）和1193R（ACGTCATCCCCACCTTCC）对16S rRNA基因V5-V7区进行PCR扩增。基于Illumina NovaSeq测序平台进行PE250测序，对有效数据在97%水平上进行α-多样性、β-多样性和操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）聚类分析，并利用Silva 138.1数据库进行物种注释。
2 结果与分析
2.1 不同部位雪茄烟叶的感官质量评价
不同部位雪茄烟叶的感官质量评价如表1所示。样品感官质量量化分数由高到低依次为中部烟叶C2>上部烟叶C1>下部烟叶C3，其中中部烟叶C2感官质量最好，其表现在香气量足、香韵丰富、杂气少、刺激弱以及余味和舒适性较好；上部烟叶C1香气量足、杂气少、略有颗粒感、刺激较弱，但烟气浓度高导致质感下降；下部烟叶C3感官质量较差，香气量弱、刺激较大、有热刺感。
表1 不同部位雪茄烟叶的感官质量评价 (分) |
| 雪茄样品 | 光泽 | 香气 | 谐调 | 杂气 | 刺激性 | 余味 | 合计 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| C1 | 5 | 32 | 5 | 13 | 12 | 12 | 79 |
| C2 | 5 | 32 | 5 | 13 | 13 | 13 | 81 |
| C3 | 5 | 31 | 5 | 13 | 11 | 11 | 76 |
2.2 不同部位雪茄烟叶的中性致香成分
表2 不同部位雪茄烟叶主要中性致香成分含量 单位：（μg/g） |
| 致香成分 | 部位 | |||
|---|---|---|---|---|
| C1 | C2 | C3 | ||
| 苯丙氨酸转化产物 | 苯甲醇 | — | 3.87 | — |
| 苯乙醛 | 18.63 | 14.70 | — | |
| 苯乙醇 | 10.66 | 16.20 | 2.78 | |
| 小计 | 29.29 | 34.77 | 2.78 | |
| 西柏烷类降解产物 | 茄酮 | 7.18 | 10.07 | 5.33 |
| 类胡萝卜素降解 产物 | 芳樟醇 | 0.49 | 0.43 | — |
| 茶香酮 | 0.62 | — | — | |
| 大马士酮 | 7.67 | 9.60 | 4.34 | |
| 香叶基丙酮 | 1.36 | 1.84 | 1.05 | |
| β-紫罗兰酮 | 1.89 | 2.24 | 1.18 | |
| 二氢猕猴桃内酯 | 4.69 | 5.08 | 3.71 | |
| 4-羟基-β-二氢大马酮 | 2.83 | 1.94 | 2.32 | |
| 巨豆三烯酮A | 5.61 | 6.64 | 5.61 | |
| 巨豆三烯酮B | 26.97 | 30.60 | 28.40 | |
| 巨豆三烯酮C | 5.18 | 5.25 | 4.97 | |
| 巨豆三烯酮D | 25.15 | 27.61 | 26.21 | |
| 9-羟基-4，7-巨豆二烯-3-酮 | 1.59 | 2.02 | 2.44 | |
| 法尼基丙酮 | — | 1.41 | 1.43 | |
| 小计 | 84.05 | 94.66 | 81.66 | |
| 叶绿素降解产物 | 新植二烯 | 59.60 | 85.31 | 83.12 |
| 其他 | 正壬醛 | 0.58 | 0.43 | — |
| 3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛 | 1.09 | 2.65 | 1.82 | |
| 十五醛 | 3.04 | 3.27 | 3.33 | |
| 植酮 | 0.80 | 0.84 | 0.78 | |
| 西松烯 | — | 0.53 | — | |
| 邻苯二甲酸二丁酯 | 0.95 | 1.43 | 1.42 | |
| （1R，2E，4S，7E，11E）-4-异丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-环十四烷并三烯-1-醇 | 28.89 | 31.31 | 14.81 | |
| 香紫苏内酯 | — | — | 2.22 | |
| （2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-环十四碳三烯-1，13-二醇 | 1.96 | 3.59 | 1.60 | |
| 香紫苏醇 | 8.40 | 8.56 | 4.66 | |
| 正二十七烷 | 3.65 | 4.41 | 5.65 | |
| 小计 | 49.36 | 57.02 | 36.29 | |
| 合计 | 229.48 | 281.83 | 209.19 | |
|
中部烟叶C2苯丙氨酸转化产物含量最高，为34.77 μg/g；下部烟叶C3含量最低，为2.78 μg/g。其中中部烟叶C2苯乙醇含量最高，为16.20 μg/g，苯甲醇仅在中部烟叶C2中检测到。各部位样品中均检测到茄酮，其中中部烟叶C2含量最高，为10.07 μg/g；下部二级C3含量最低，为5.33 μg/g。
烟草香味成分中，大部分化合物为类胡萝卜素降解产物，其是烟草中重要的萜烯类化合物之一。由表2可知，中部烟叶C2类胡萝卜素降解产物含量最高，为94.66 μg/g；下部烟叶C3含量最低，为81.66 μg/g，大马士酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮A/B/C/D在中部烟叶C2中含量均最高。不同部位样品中，新植二烯是含量最大的单体化合物。所有样品中均检测到新植二烯，其在中部烟叶C2中含量最高，为85.31 μg/g；上部烟叶C1最低，为59.60 μg/g。
其他类型中性致香成分中，中部烟叶C2含量最高，为57.02 μg/g；下部烟叶C3最低，为36.29 μg/g，3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯基）-2-丙烯醛、植酮、邻苯二甲酸二丁酯、（1R，2E，4S，7E，11E）-4-异丙基-1，7，11-三甲基-2，7，11-环十四烷并三烯-1-醇、（2E，6E，11Z）-3，7，13-三甲基-10-（2-丙基）-2，6，11-环十四碳三烯-1，13-二醇和香紫苏醇在中部烟叶C2中含量均最高，各类致香成分可直接或间接影响雪茄烟叶的感官质量。
2.3 不同部位雪茄烟叶的微生物多样性与群落结构
2.3.1 α-多样性分析
2.3.2 β-多样性分析
β-多样性反映不同样本间的多样性差异。不同部位雪茄烟叶中微生物群落主坐标分析如图2所示，第一和第二主坐标对微生物结构变异的贡献率分别为55.30%和25.19%，不同部位样本间的离散程度较大，微生物群落组成相似度较低，说明不同部位雪茄烟叶的微生物群落结构组成差异较大。
2.3.3 OTU分析
基于OTU水平绘制了雪茄烟叶表面微生物群落韦恩图，用于表示微生物群落结构在OTU水平的分布情况。由图3可知，不同部位雪茄烟叶共有的OTU数为88个，OTU总数由多到少排序依次为下部烟叶C3>中部烟叶C2>上部烟叶C1，下部烟叶C3的OTU总数和特有OTU数均最多，分别为1 313和1 092个，明显高于其他部位。
2.3.4 微生物群落组成及相对丰度分析
不同部位雪茄烟叶中微生物在门水平上的群落结构变化如图4所示，雪茄烟叶微生物组成主要包括5个优势门类，分别是变形菌门（Proteobacteria）、蓝菌门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）。变形菌门是雪茄样品中主要优势菌门，上部烟叶C1、中部烟叶C2和下部烟叶C3的相对丰度分别为93.22%、76.89%和61.51%；蓝菌门在中部烟叶C2和下部烟叶C3中占比较大，相对丰度分别为17.04%和9.78%。在属水平上雪茄烟叶中相对丰度前20的微生物如图4所示，主要优势菌属有5个，分别是假单胞菌属（Pseudomonas）、泛菌属（Pantoea）、未命名菌属、弧菌属（Vibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas），其中假单胞菌属为优势菌属，其相对丰度表现为上部烟叶C1（49.94%）>中部烟叶C2（20.56%）>下部烟叶C3（10.82%）；泛菌属和未命名菌属在中部烟叶C2样品中占绝对优势，相对丰度分别为28.09%和17.04%。表明不同部位雪茄烟叶在门和属水平上的微生物相对丰度存在差异。
2.3.5 微生物代谢功能分析
参考KEGG数据库注释结果[15-16]，选取不同部位雪茄烟叶相对丰度排名前10的功能信息，生成功能相对丰度柱状图。由图5可知，不同部位样品相对丰度排名前10的主要代谢通路集中在信号转导、细胞过程（K03406、K02029、K02030、K02015、K01992、K01990和K06147），氨基酸代谢（K00799）、脂肪酸代谢（K00059）和遗传信息处理（K03088），表明不同部位烟叶表面微生物群落参与了基本的代谢过程。在上部烟叶C1中，部分信号转导和细胞过程、氨基酸代谢通路活跃度明显高于其他部位；在下部烟叶C3中，脂肪酸代谢、遗传信息处理通路活跃度高于其他部位，说明不同部位的同种代谢通路丰度存在差异。
3 讨论
3.1 不同部位烟叶的感官质量及中性致香成分
各样品感官质量量化分数由高到低依次为中部烟叶C2>上部烟叶C1>下部烟叶C3，这与主要中性致香成分总含量排序一致。中部烟叶C2感官质量综合评分最高，香气量足、香韵丰富、余味好，这与其苯丙氨酸转化产物、西柏烷类降解产物和类胡萝卜素降解产物等各类型香气成分含量高密切相关。中部烟叶C2的苯甲醇和苯乙醇含量最高，苯甲醇可提供烟叶弱花香，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香韵，对增香掩杂具有积极作用。茄酮是烟草中西柏烷类降解产物的代表，是烟草中含量最为丰富的致香成分之一，可增加烟草香韵，使烟气丰满、醇和且细腻。中部烟叶C2的茄酮含量最高，说明其烟叶品质较佳。中部烟叶C2类胡萝卜素降解产物中的大马士酮、香叶基丙酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮A/B/C/D等单体化合物含量均较高，大马士酮具有强烈的玫瑰花香、果香；香叶基丙酮可赋予雪茄样品微玫瑰香、清甜香；β-紫罗兰酮稀释时有紫罗兰花香气，木香香韵；二氢猕猴桃内酯有淡清凉感，可提高舒适性；巨豆三烯酮在烟叶中起发香作用，使烟气浓度增加，具有增香掩杂作用。中部烟叶C2的新植二烯含量最高，上部烟叶C1最低，新植二烯是烟叶中重要的非色素类萜烯之一，新植二烯具有减少刺激、醇和烟气以及进一步降解形成其他低分子质量香气成分的作用。
3.2 不同部位烟叶的微生物群落结构及代谢功能
试验表明，不同部位雪茄烟叶微生物群落结构组成差异较大，既有共性也有差异，可能与烟叶生长部位相关，下部烟叶接近土壤，温湿度适宜微生物的生长和繁殖，这与包可翔等[17]研究结果相似。
微生物群落组成及相对丰度分析结果表明，不同部位雪茄烟叶在门和属水平上微生物的组成既有相同又有差异，不同部位会影响雪茄烟叶的微生物群落结构与优势菌群，以优势菌属差异较为明显，假单胞菌属是上部烟叶C1的优势菌属，而泛菌属和未命名菌属则在中部烟叶C2中占据优势。假单胞菌属具有降解烟碱的能力，影响雪茄烟叶吸食劲头，进而影响感官品质[8]。肠杆菌属（Enterobacter）是中部烟叶C2的独有菌属，其是形成代表性风味化合物的重要贡献者之一[18]，已被证实可利用烟草中存在的果胶、糖和有机酸等物质[19-20]，同时对植物生长、代谢和有害生物防治有积极作用[21]，因此推测肠杆菌属可能对雪茄烟叶感官品质产生一定的积极作用。
4 结论
（1）本试验以品种云雪39号的不同部位烟叶为研究对象，通过感官质量评价和主要中性致香成分分析发现，烟草各部位的感官质量评分排序与主要中性致香成分含量排序结果一致，中部烟叶C2的感官质量综合评分最高，可能与对应的中性致香成分总量和部分单体香气成分含量较高有关。
（2）通过α、β多样性分析以及OTU分析发现，OTU总数由多到少排序依次为下部烟叶C3>中部烟叶C2>上部烟叶C1，下部烟叶C3中微生物群落多样性较丰富；不同部位烟叶的优势菌门、优势菌属相对丰度存在差异，从而导致不同部位的同种代谢通路也存在差异。在烟叶发酵过程中，部分微生物代谢产物自身是香气物质，部分代谢产物对烟叶化学成分变化起催化作用，间接促进大分子物质的分解、转化和增香化合物的产生，进一步影响不同部位雪茄烟叶的感官质量和中性致香成分含量。
（3）本研究以不同部位雪茄烟叶为变量，较为系统地分析其感官质量、中性致香成分含量和微生物群落结构特征，可为不同部位雪茄烟叶的应用与开发以及发酵功能微生物的筛选提供参考。