1 材料与方法
1.1 样品配制信息
人参阿胶口服液主要由阿胶和人参制备，使用时吸取原液。配方采用药食同源的成分，以确保长期服用的安全性，无毒副作用。阳性对照：瑞克®生血宁片（简称生血宁，武汉联合药业），用标准稀释水作为溶剂；破壁灵芝孢子粉（中国金日制药），用标准稀释水作为溶剂。
1.2 实验动物
斑马鱼在28 ℃的水中均匀饲养。实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2022-0004；IACUC伦理审查号：IACUC-2023-8073-01。
1.3 试剂与仪器
甲基纤维素（上海阿拉丁）；苯肼（上海依赫生物）；邻联茴香胺（Sigma）；无水乙酸钠（国药集团）；无水乙醇（上海阿拉丁）；酒石酸长春瑞滨注射液（江苏豪森药业）；氯化钠注射液（湖南科伦制药）；荧光微球（Sigma）。
解剖显微镜（OLYMPUS）；CCD相机（上海土森视觉科技）；精密电子天平（OHAUS）；6孔板（浙江贝兰伯生物）；共聚焦连续变倍荧光显微镜（Nikon）；显微注射仪（Narishige）；拉针仪（Narishige）。
1.4 测定指标和方法
1.4.1 最大耐受浓度（MTC）
（1）调节气血。将受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑马鱼放入6孔板中，分成正常对照组、模型对照组和人参阿胶口服液组。其中，人参阿胶口服液组浓度分别为7.81、15.60、31.20、62.50和125.00 μL/mL。6孔板置于28 ℃，6 h后，除正常对照组外，其余各组均加入苯肼。随后28 ℃，24 h后，测定其调节气血的最大耐受浓度（MTC）。（2）调节免疫力功能。取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑马鱼放置于6孔板中，分成正常对照组、模型对照组和人参阿胶口服液组。其中，人参阿胶口服液组的浓度分别为0.98、1.95、3.91、7.81和15.60 μL/mL。6孔板置于28 ℃，培养6 h后，除正常对照组外，其余各组均通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液。随后28 ℃，96 h后，测定其调节免疫力的最大耐受浓度（MTC）。
1.4.2 调节气血
取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑马鱼放置于6孔板中，分成正常对照组、模型对照组、阳性对照组和人参阿胶口服液组。其中，阳性对照组生血宁浓度250.00 µg/mL，人参阿胶口服液组的浓度分别为7.81、15.60和31.20 μL/mL。样品板置于28 ℃，6 h后，除正常对照组外，其余各组均加入苯肼。28℃，1 h后，使用邻联茴香胺进行染色。随后，选取斑马鱼在显微镜下拍照，并用NIS-Elements D 3.20软件处理数据。
1.4.3 调节免疫力
（1）促进巨噬细胞吞噬。取受精后3 d（3 dpf）的野生型AB品系斑马鱼放置于6孔板中，分成正常对照组、模型对照组、阳性对照组和人参阿胶口服液组。其中，阳性对照组的破壁灵芝孢子粉浓度125.00 µg/mL，人参阿胶口服液组的浓度分别为0.98、1.95和3.91 μL/mL。正常对照组仅注射荧光微球，其余各试验组均通过静脉注射酒石酸长春瑞滨和荧光微球建立斑马鱼免疫力低下模型。28 ℃，96 h后，选取斑马鱼在荧光显微镜下进行拍照，并使用Image-J软件处理数据。（2）T细胞减少。取受精后3 d（3 dpf）的转基因T细胞红色荧光斑马鱼放置于6孔板中，分成正常对照组、模型对照组、阳性对照组和人参阿胶口服液组。其中，阳性对照组的破壁灵芝孢子粉浓度125.00 µg/mL，人参阿胶口服液组的浓度分别为0.98、1.95和3.91 μL/mL。除正常对照组外，其余各试验组均通过静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼免疫力低下模型。28 ℃，48 h后，选取斑马鱼在荧光显微镜下进行拍照，并使用NIS-Elements D 3.20软件采集数据。
1.5 数据处理
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 人参阿胶口服液调节气血的MTC测算
由表1可知，正常对照组和模型对照组中的斑马鱼均未死亡。人参阿胶口服液浓度在7.81~31.20 μL/mL未见斑马鱼死亡现象，与模型对照组状态相似。人参阿胶口服液在浓度为62.50 μL/mL时造成37%的斑马鱼死亡，在浓度为125.00 μL/mL时造成47%的斑马鱼死亡。可见，人参阿胶口服液的最大安全浓度（MTC）为31.20 μL/mL。因此，在进行调节气血试验时，选择人参阿胶口服液的低、中和高浓度分别为7.81、15.60和31.20 μL/mL。
表1 人参阿胶口服液改善贫血功效的MTC |
| 组别 | 人参阿胶口服液浓度/（μL/mL） | 死亡数/尾 | 死亡率/% | 表型 |
|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 0 | 0 | 0 | 未见明显异常 |
| 模型对照组 | 0 | 0 | 0 | 未见明显异常 |
| 人参阿胶口服液组 | 7.81 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 |
| 15.60 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 | |
| 31.20 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 | |
| 62.50 | 11 | 37 | 较模型对照组状态差 | |
| 125.00 | 14 | 47 | 较模型对照组状态差 |
2.2 人参阿胶口服液调节气血评价
由表2可知，正常对照组的斑马鱼心脏红细胞染色强度值为4 936，而模型对照组的染色强度值仅为779，其心脏红细胞染色强度显著降低（P< 0.001），说明斑马鱼贫血模型建立成功。阳性对照组给予生血宁（250.00 μg/mL）的斑马鱼心脏红细胞染色强度值为4 956，与模型对照组相比明显升高（P<0.001）。7.81 μL/mL的人参阿胶口服液组红细胞染色强度值虽有上升趋势，但与模型对照组差异无统计学意义（P>0.05）。人参阿胶口服液浓度为15.60和31.20 μL/mL时，心脏红细胞染色强度与模型对照组相比，分别增强了276.64%和570.47%。说明在15.60和31.20 μL/mL浓度下，人参阿胶口服液对苯肼诱导的斑马鱼贫血具有显著的改善作用。
表2 人参阿胶口服液改善贫血功效评价 |
| 组别 | 浓度 | 心脏红细胞染色强度（像素） |
|---|---|---|
| 正常对照组 | 4 936 ± 114.00*** | |
| 模型对照组 | 779 ± 29.40 | |
| 阳性对照组 | 250.00 μg/mL | 4 956 ± 94.10*** |
| 人参阿胶口服液组 | 7.81 µL/mL | 2 182 ± 132.00 |
| 15.60 µL/mL | 2 934 ± 209.00** | |
| 31.20 µL/mL | 5 223 ± 92.90*** |
|
2.3 人参阿胶口服液调节免疫力MTC测算
由表3可知，正常对照组和模型对照组中的斑马鱼均未见死亡。人参阿胶口服液在0.98~3.91 μL/mL的浓度范围内未见斑马鱼死亡现象，与模型对照组状态相似。人参阿胶口服液在浓度为7.81 μL/mL时造成10%的斑马鱼死亡，在浓度为15.60 μL/mL时造成60%的斑马鱼死亡。由此可见，人参阿胶口服液的增强免疫力功效的MTC为3.91 μL/mL。因此，进行增强免疫力功效试验时，选择的人参阿胶口服液低、中和高浓度分别为0.98、1.95和3.91 μL/mL。
表3 人参阿胶口服液增强免疫力功效的MTC |
| 组别 | 人参阿胶口服液浓度/（μL/mL） | 死亡数/尾 | 死亡率/% | 表型 |
|---|---|---|---|---|
| 正常对照组 | 0 | 0 | 0 | 未见明显异常 |
| 模型对照组 | 0 | 0 | 0 | 未见明显异常 |
| 人参阿胶口服液组 | 0.98 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 |
| 1.95 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 | |
| 3.91 | 0 | 0 | 与模型对照组状态相似 | |
| 7.81 | 3 | 10 | 较模型对照组状态差 | |
| 15.60 | 18 | 60 | 较模型对照组状态差 |
2.4 人参阿胶口服液调节免疫力评价
2.4.1 促进巨噬细胞吞噬
模型对照组斑马鱼体内剩余荧光颗粒数目显著高于正常对照组（P<0.001），这说明酒石酸长春瑞滨诱导的斑马鱼免疫力低下模型建立成功。与模型对照组相比，阳性对照组（破壁灵芝孢子粉125.00 μg/mL）斑马鱼体内剩余荧光颗粒数目明显降低（P<0.001）；人参阿胶口服液在低浓度组（0.98 μL/mL）、中浓度组（1.95 μL/mL）和高浓度组（3.91 μL/mL）的斑马鱼体内剩余荧光颗粒数目明显降低（P<0.001），分别降低了34.35%、40.42%和52.10%，且人参阿胶口服液呈剂量依赖性。说明在低、中和高3种浓度条件下，人参阿胶口服液显著减少了酒石酸长春瑞滨诱导的斑马鱼体内残留荧光颗粒数量，能够调节免疫力（表4）。
表4 人参阿胶口服液促进巨噬细胞吞噬功效评价 |
| 组别 | 浓度 | 斑马鱼体内剩余荧光颗粒数量/个 |
|---|---|---|
| 正常对照组 | 22.00 ± 0.91*** | |
| 模型对照组 | 42.80 ± 1.09 | |
| 阳性对照组 | 125.00 μg/mL | 29.10 ± 0.57*** |
| 人参阿胶口服液组 | 0.98 µL/mL | 28.10 ± 1.10*** |
| 1.95 µL/mL | 25.50 ± 0.82*** | |
| 3.91 µL/mL | 20.50 ± 0.91*** |
2.4.2 增强T细胞
如表5所示，模型对照组斑马鱼T细胞荧光强度显著低于正常对照组（P<0.001），表明酒石酸长春瑞滨诱导的斑马鱼免疫力低下模型建立成功。而阳性对照组使用破壁灵芝孢子粉（125.00 μg/mL）后，斑马鱼T细胞荧光强度显著高于（P<0.001）模型对照组。与模型对照相比，0.98 μL/mL的人参阿胶口服液组T细胞荧光强度值虽有上升趋势，但差异无统计学意义（P>0.01）。在人参阿胶口服液中浓度组（1.95 μL/mL）和高浓度组（3.91 μL/mL）中，斑马鱼T细胞荧光强度值分别为23 229和25 075，与模型对照组相比，分别提高了110.24%和126.94%，且差异具有统计学意义（P<0.001）。说明在1.95和3.91 μL/mL浓度下，人参阿胶口服液具有增强T细胞功能的作用，可调节免疫功能。
表5 人参阿胶口服液增强T细胞功效 |
| 组别 | 浓度 | T细胞荧光强度（像素） |
|---|---|---|
| 正常对照组 | 32 111 ± 1279*** | |
| 模型对照组 | 11 049 ± 1043 | |
| 阳性对照组 | 125.00 μg/mL | 19 387 ± 908*** |
| 人参阿胶口服液 | 0.98 µL/mL | 17 848 ± 1272 |
| 1.95 µL/mL | 23 229 ± 630*** | |
| 3.91 µL/mL | 25 075 ± 1316*** |
3 结论与讨论
人参作为一种药食同源的植物，能够补脾益肺，生津安神，是补益和治疗虚劳的首选药物，有助于预防疾病[12]。从人参中提取的各种生物活性化合物具有多种功能，包括抗氧化[13]、加强造血功能[14]、抗癌[15]、降血糖[16]、皮肤保护[17]、抗骨质疏松[18]和抗感染[19]等。董思颖等[20]研究了人参肉桂膏对增强斑马鱼免疫力、缓解疲劳和减少肌肉流失的效果，结果表明，人参肉桂膏在高浓度组（0.4和0.8 mg/mL）中巨噬细胞的总荧光强度高于破壁灵芝孢子粉胶囊组，而在其他浓度组（0.2 mg/mL）中，其荧光强度较模型组有明显改善。人参肉桂膏对巨噬细胞减少症的斑马鱼有显著的改善作用，并能增强斑马鱼的免疫力。贫血患者在食用阿胶28 d后，血清铁和血红蛋白浓度显著增加，这表明阿胶可以改善贫血[21]。林健等[22]通过使用黄芪阿胶补铁口服液来改善大鼠的缺铁性贫血，结果发现，经过32 d的治疗，各剂量组的大鼠血红蛋白水平均显著高于低铁对照组，表明黄芪阿胶补铁口服液对缺铁性贫血具有改善作用。陈永刚[23]研究了健脾益肾方与复方阿胶浆联合治疗贫血的效果，发现接受这种联合治疗的贫血患者，其红细胞计数等外周血象指标均显著优于对照组，有助于改善贫血症状。本研究发现，人参阿胶口服液具有改善贫血和增强免疫力功效，与以上研究结果相似。
综上，本研究采用斑马鱼模型，探究人参阿胶口服液在调节气血和免疫力方面的作用。结果表明，人参阿胶口服液浓度在7.81~31.20 μL/mL对斑马鱼无毒性；在浓度为15.60和31.20 μL/mL的人参阿胶口服液处理组中，能够明显提升苯肼诱导的贫血斑马鱼的心脏红细胞染色强度，与模型对照组相比，分别增强了276.64%和570.47%。人参阿胶口服液浓度在0.98~3.91 μL/mL对斑马鱼无毒性；浓度为0.98、1.95 和3.91 μL/mL的人参阿胶口服液减少了石酸长春瑞滨诱导的斑马鱼体内残留荧光颗粒数目，与模型对照组相比，分别降低了为34.35%、40.42%和52.10%，促进巨噬细胞的吞噬功效；浓度为1.95 和3.91 μL/mL的人参阿胶口服液显著增强了T细胞荧光强度，与模型对照组相比分别提高了110.24%和126.94%，增强了T细胞功效。综上所述，人参阿胶口服液具有调节气血和免疫力的作用。