烟管菌（Bjerkandera adusta），又称黑管菌，属担子菌纲（Basidiomycetes）多孔菌目（Polyporales）多孔菌科（Polyporaceae）烟管菌属（Bjerkandera），是一种木腐型真菌[1]。多数大型真菌的子实体不易被病菌或昆虫侵袭[2]，且受伤后的子实体能产生大量具有抗菌、杀虫等效果的活性代谢产物[3]，可作为生物防治植物病虫害的重要资源。Dománski等[4]研究表明，烟管菌可有效防治在栎树上发生的褐腐病。汪华等[5]和张旭辉[6]报道指出，烟管菌对纹枯病菌、黄萎病菌和青枯病菌等具有较好的防治效果，以该菌株制备的散粒剂可以防治番茄青枯病、立枯病，棉花根腐病、黄萎病以及西瓜根腐病等。
1 材料与方法
1.1 试验材料
PDA培养基（分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司）；羊角椒，采购于贵州省黔东南州凯里经济开发区农贸市场。
SPX-150B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；SW-CJ-2D型双人净化工作台（上海苏净实业有限公司）；BGZ-246型电热鼓风干燥箱和LDZX-50kbs型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；光学显微镜和倒置光学显微镜（日本OlympusPCR）；Gel DOC XT凝胶成像系统仪 （美国BIO-RAD）。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株的分离纯化
无菌条件下，将洗净的新鲜羊角椒切成小块（5 mm×5 mm），依次放入1%次氯酸钠溶液中30 s后取出吸干，再放入75%乙醇中消毒20 s，最后用无菌水漂洗3次，吸干表面水分。将消毒好的辣椒组织小块呈“品”字形置于PDA固体培养基中，放入恒温培养箱于28 ℃培养3～5 d。待菌落长出后，从中选取典型的白色单菌落进行多次划线分离培养，直至获得纯菌种。
1.2.2 菌株的分类鉴定
观察平板培养中的菌株菌落形态特征，测定其生长速率，于显微镜下观察其孢子及菌丝形态特征。按照SK8259试剂盒操作步骤提取真菌基因组DNA，采用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。引物序列：ITS（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），由上海生工合成。扩增体系为25 μL：10×PCR Buffer 5 μL，50 mmol/L MgSO4 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5 U/μL TaqDNA酶0.5 μL，正反向引物（10 μmol/L ITS1和ITS4）各1 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序设定：预变性 95 ℃，5 min；变性94 ℃，30 s，退火57 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，30个循环；后延伸 72 ℃，10 min，4 ℃保存。
1.2.3 菌株生长条件优化
参照文献[14]将菌种活化后，加入2 mL/L的吐温-80孢子洗脱液，以接种环轻刮菌落表面反复吹打，之后将洗脱液保存在离心管中，使用血细胞计数板计数，再用孢子洗脱液将浓度调至1×106/mL，备用。以碳源、氮源、促进剂及pH为考察因素，探讨不同碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖及可溶性淀粉）、氮源（氯化铵、硫酸铵、硝酸钾、酵母膏和蛋白胨）、促进剂（吐温-80和油酸）及pH（5.0～12.0）条件下菌株的生长情况。配制不同的真菌液体培养基时，分别将基础培养基中的20 g葡萄糖换算成有效成分含量相当的其他碳源、氮源或促进剂物质，调节pH，添加20 g/L琼脂粉制成固体培养基；以不添加任何碳源或氮源物质的培养基为对照组。平板接种后置于培养箱中28 ℃培养，并开始每天对不同生长条件下的菌丝生长速度进行测量，直至菌丝长满整个平皿，平行试验3次。
1.3 数据处理
利用Excel软件进行数据处理，用GraphPad Prism 5 软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 菌株的形态特征
2.2 菌株的分子生物学鉴定
经测序，菌株LJ-1的基因序列大小约为515 bp。由图2可知，LJ-1的基因序列与Bjerkandera adusta 在同一个分支上，亲缘关系最近，序列相似性为82%，与Trichoderma harzianum亲缘关系最远。初步判断LJ-1菌株可能为Bjerkandera adusta，并命名Bjerkandera adusta LJ-1。
2.3 菌株的生长条件优化
2.3.1 碳源
由图3可知，同一菌株在不同碳源条件下的菌丝生长速度有所不同。当蔗糖为碳源时，菌株菌丝生长速度最快，平均为2.27 cm/d，当葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉为碳源时，菌丝生长速度较快，分别为2.17、2.10和2.04 cm/d；当乳糖为碳源时，菌丝生长速度较慢，平均为1.58 cm/d，与蔗糖碳源组差异具有统计学意义（P<0.05）。由此可知，菌株在固体培养基中生长的最适碳源为蔗糖。
2.3.2 氮源
以酵母膏和蛋白胨为氮源时，菌株在固体培养基中菌丝生长速度较快，分别为2.41和1.97 cm/d，且两者的菌丝长势均致密均匀；其次为硝酸钾和硫酸铵，平均生长速度分别为1.77和1.74 cm/d，但前者菌丝长势不良，菌丝体较稀疏，而后者菌丝长势均匀且密集；以氯化铵为氮源时，菌丝生长速度最慢，为1.09 cm/d，长势较好，菌丝较均匀。酵母膏组、氯化铵组与对照组差异具有统计学意义（P<0.05）。综合菌丝生长速度和生长势可知，菌株生长最适氮源为酵母膏（图4）。
2.3.3 促进剂
由图5可知，同一菌株在不同促进剂处理下的菌落生长速度有所不同，在以油酸为促进剂的固体培养基中菌丝平均生长速度较快，为2.26 cm/d，菌丝长势较好，致密均匀；在以吐温-80为促进剂的固体培养基中菌丝平均生长速度较慢，为1.77 cm/d，菌丝长势稀疏。综合可知，菌株生长最适促进剂为油酸。
2.3.4 pH
由图6可知，在pH 5.0～12.0的固体培养基上，菌株LJ-1具备一定的生长能力。但其长势以及生长速度存在一定的差异。在pH 6.0时，菌丝生长速度较快，为1.61 cm/d，但菌丝生长较稀疏不均匀；在pH为10.0时，菌丝生长速度为1.59 cm/d，菌丝生长致密均匀；pH为5.0和9.0时，菌丝生长速度分别为1.54和1.52 cm/d，菌丝的分布极为稀疏且不均匀。在pH为11.0时，菌丝生长速度为1.56 cm/d，菌丝长势较好且致密均匀；pH为12.0时，菌丝生长速度较慢，为1.50 cm/d，菌丝长势不均匀，有的区域仅有少量菌丝勉强生长，而大片的区域则完全没有菌丝的踪迹。与对照组相比，不同pH组间生长速度差异无统计学意义（P>0.05）。综合考量菌丝的生长速度以及长势情况，确定该菌株生长的最适pH为 6.0～8.0。在这个pH范围内，菌丝生长速度较为理想，且呈现出良好的长势状态。
3 结论与讨论
蔡文韬[15]从辣椒果肉中分离获得一株解淀粉芽孢杆菌，发现该菌株对辣椒疫霉病菌、辣椒黑霉病菌及辣椒炭疽病菌3种病原菌均有明显的抑制作用。朱晓琴等[16]成功从辣椒内生菌中筛选出1株解淀粉芽孢杆菌SQ6菌株，该菌株对胶孢炭疽菌呈现出明显的抑制作用。本研究从健康新鲜辣椒中分离获得了1株内生真菌，经形态学和分子生物学鉴定，初步确定该真菌为烟管菌，拓宽了辣椒内生菌的种类。内生菌来源不同、种属不一，所需的营养成分有所不同；其生长的环境条件不同，导致各内生菌的代谢途径及产物、功能活性也必然存在差异[6，8，17]。因此，本研究从碳源、氮源、促进剂及pH几个因素探究了烟管菌 LJ-1生长的最佳条件，发现该菌生长的最适碳源是蔗糖，能够为其生长提供充足的能量来源；最适氮源为酵母膏，为其生命活动提供关键的营养支持；最适促进剂是油酸，可有效促进其生长发育；最适 pH为6.0～8.0，在此条件下，其能够良好地生长繁殖。
综上，本研究通过菌株的分离纯化与鉴定，成功从辣椒上分离获得了1株内生真菌，命名为烟管菌LJ-1；该菌的最适碳源、氮源和促进剂分别为蔗糖、酵母膏和油酸，最适pH为6.0～8.0。研究结果为辣椒内生菌烟管菌的深入研究提供了参考，也为进一步探索其生物学特性和应用价值奠定了基础。