在农作物病虫害的防治实践中，长期大量施用化学农药不仅会导致病虫耐药性的形成，还会对土壤环境造成污染，破坏生态平衡，一定程度上影响农业可持续发展进程[1]。生物防治是一种促进可持续农业发展的重要策略，其中利用微生物进行害虫防治是生物防治策略中重要的组成部分之一[2]。
球孢白僵菌是子囊菌门的昆虫病原真菌，具有广泛的地理分布特征，其生态位覆盖从低海拔地区至高山区域。该菌通过无性生殖产生分生孢子，其菌落形态呈绒状[3]。球孢白僵菌具有侵染昆虫体表和体内的能力，其分生孢子能在虫体表皮萌发，并长出芽管[4]；同时，分生孢子产生的脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶等物质能够溶解昆虫表皮，为芽管侵入虫体创造条件；芽管穿透表皮侵入虫体，在虫体内生长繁殖，消耗寄主的营养物质，并产生白僵菌素和卵孢霉素等代谢产物，导致虫体中毒死亡[5]。生产上可通过工业化培养球孢白僵菌，其产生的分生孢子可进一步开发为微生物杀虫剂。
球孢白僵菌不同菌株在营养生长、产孢量以及对昆虫的毒力等方面表现出显著差异。因此，选育产孢量高、致病力强且遗传稳定的菌株，是开发球孢白僵菌微生物杀虫剂的关键。获得优良菌株的方法包括自然分离筛选、诱变选育、杂交选育以及基因工程技术构建等[6]。诱变选育作为一种经典方法，能够快速获得优良突变菌株。特别是紫外诱变，作为一种有效的手段，能够干扰DNA的正常复制过程，引起基因突变，从而在短时间内筛选出具有正向突变的菌株[7]。苏筱雨等[8]通过紫外诱变筛选出了对美国白蛾具有高毒力的白僵菌菌株。球孢白僵菌杀虫剂的生产依赖充足的分生孢子产量，而突变菌株的产孢性能在适宜的培养条件下可以得到充分发挥。目前，固态发酵是生产上获取球孢白僵菌分生孢子的主要方法，其优势在于能够利用廉价的农副产品作为基质，这不仅降低了生产成本，而且促进了农业废弃资源的循环利用[9]。本研究选取球孢白僵菌作为原始菌株，采用紫外诱变技术，旨在选育出产孢量高、对昆虫毒力强且遗传稳定的突变菌株。同时，对突变菌株的固态发酵条件进行了优化，以进一步提高突变菌株的产孢量。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌种
球孢白僵菌（Beauveria bassiana Q2505），实验室保藏菌种。
1.1.2 培养基
PDA培养基，其组成为琼脂20 g、土豆200 g、葡萄糖20 g和蒸馏水1 000 mL；固态发酵培养基由麦麸、米糠、硝酸钾和水构成。
1.1.3 试验仪器
HI-4A数显恒温多头磁力搅拌器（金坛市杰瑞尔电器有限公司），组合式摇床（太仓市强乐试验设备有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），光学显微镜（上海长方光学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 球孢白僵菌菌悬液制备
先将球孢白僵菌接种于PDA培养基平板上，于26 ℃恒温条件下培养，直至产生分生孢子。采用0.1%吐温80溶液将平板上的孢子洗脱至无菌烧杯中，并在摇床中以180 r/min转速振荡2 h以促进孢子分散。孢子悬液用擦镜纸过滤后，采用血球计数板调节孢子悬液浓度至1.0×107个/mL[10]。
1.2.2 球孢白僵菌的紫外诱变
取5 mL球孢白僵菌原始菌株孢子悬液，置于无菌平皿中，并在磁力搅拌器上使孢子悬液均匀分散；采用30 W紫外灯（紫外灯距离平皿30 cm），分别对孢子悬液进行0、2、4、6、8和10 min的照射处理。对于诱变处理0、2、4和6 min的孢子悬液，分别稀释1 000倍和100倍；而诱变处理8和10 min的孢子悬液，分别稀释100倍和10倍。稀释后的孢子悬液混匀后，分别取100 µL均匀涂布于PDA固体培养基上。整个操作过程需在避光条件下进行，涂布后的培养基在26 ℃避光培养3 d，随后计算致死率，并绘制致死率曲线。
1.2.3 突变菌株的筛选
对经诱变处理的球孢白僵菌孢子进行平板培养，待长出菌落后重新接种于PDA培养基上培养，直至长出成熟孢子。随后测量菌落直径和面积，并测定单位面积的孢子产量。通过与原始菌株比较，筛选出菌落直径和面积大且单位面积产孢量高的正向突变菌株。
1.2.4 突变菌株的毒力测定
取2 mL孢子浓度为1×107个/mL的突变菌株与原始菌株，对2龄小菜蛾幼虫进行喷雾处理，以0.1%吐温80无菌水作为对照；每组试验3次重复，每重复20头幼虫。处理后的小菜蛾幼虫被置于光照培养箱内（12L∶12D，25 ℃），于透明塑料盒中饲养，每日记录小菜蛾幼虫的死亡情况。对死亡幼虫保湿培养5 d，检查虫体是否出现白僵菌菌丝或孢子，从而确定幼虫的死亡是否由白僵菌感染所致。根据幼虫的每日死亡率，计算校正死亡率，并构建死亡率与时间的回归方程，计算出半致死时间[11]。
1.2.5 突变菌株的遗传稳定性测定
将筛选得到的突变菌株接种于PDA培养基上，连续传代培养5代，测定每代产孢量，分析突变菌株的遗传稳定性。
1.2.6 突变菌株的固态发酵条件优化
采用麦麸与米糠混合基质固态发酵制备球孢白僵菌孢子。先将麦麸与米糠按一定比例混匀，并加入适量的水和硝酸钾，混合物经115 ℃立式压力蒸汽灭菌锅灭菌30 min，冷却至室温，在超净台中接种球孢白僵菌菌悬液。接种后用接种铲将其混匀，并用封口膜封口，然后置于摇床中，在26 ℃条件下培养5 d。
（1）固态发酵基质比例优化。确定基础培养基中硝酸钾含量0.2%，含水量50%，接种量10%，培养温度26 ℃，变换培养基质中麦麸与米糠的质量比，使其分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3，经培养后测定产孢量，以确定最佳基质比例。
（2）硝酸钾含量优化。确定基础培养基中基质质量比1∶1，接种量10%，含水量50%，培养温度26 ℃，改变硝酸钾的含量，使其分别为0.2%、0.3%、0.4%、0.5和0.6%，经培养后测定产孢量，以确定最佳硝酸钾含量。
（3）接种量优化。确定基础培养基中基质质量比1∶1，硝酸钾含量0.3%，含水量50%，培养温度26 ℃，改变接种量，使其分别为4%、6%、8%、10%和20%，经培养后测定产孢量，以确定最佳接种量。
（4）含水量优化。确定基础培养基中基质质量比1∶1，硝酸钾含量0.3%，接种量10%，改变含水量，使其分别为10%、20%、40%、50%和60%，经培养后测定产孢量，以确定最佳含水量。
1.2.7 响应面试验优化
基于单因素试验中含水量影响不明显，因此，采用基质比、接种量和无机盐含量三因素进行响应面试验，进一步优化突变菌株的发酵条件，其具体因素水平设计如表1所示。
表1 突变菌株固态发酵优化响应面因素与水平 |
| 水平 | 因素 | ||
|---|---|---|---|
| A麦麸米糠基质比 | B无机盐含量/% | C接种量/% | |
| -1 | 2∶1 | 0.2 | 8 |
| 0 | 1∶1 | 0.3 | 10 |
| 1 | 1∶2 | 0.4 | 12 |
1.2.8 产孢量测定
取培育5 d的固态基质1.0 g，置于装有30 mL 0.1%吐温80溶液的离心管中，置于180 r/min摇床中振荡2 h，使孢子均匀分散；用4层无菌纱布过滤多余基质和残渣，得到孢子悬液，采用血球计数板在光学显微镜下计数。
1.3 数据处理与统计分析
采用Excel 2019软件对试验数据进行整理，Origin 8.0软件进行作图，利用Design Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和回归分析。
2 结果与分析
2.1 球孢白僵菌的诱变选育
2.1.1 紫外诱变致死率
2.1.2 球孢白僵菌紫外诱变筛选
表2 原始菌株与突变菌株生长直径、面积以及产孢量比较 |
| 序号 | 编号 | 直径/cm | 面积/cm2 | 单位面积总孢子数目/×109 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | S0 | 2.6 | 5.31 | 1.589 |
| 2 | S1 | 3.1 | 7.54 | 1.120 |
| 3 | S2 | 4.2 | 14.85 | 4.851 |
| 4 | S3 | 3.0 | 7.07 | 1.564 |
| 5 | S4 | 4.5 | 15.90 | 4.227 |
| 6 | S5 | 3.0 | 7.07 | 1.913 |
| 7 | S6 | 3.5 | 9.62 | 1.409 |
| 8 | S7 | 3.6 | 10.17 | 2.106 |
| 9 | S8 | 3.3 | 8.55 | 1.669 |
| 10 | S9 | 4.5 | 15.90 | 4.379 |
| 11 | S10 | 3.3 | 8.55 | 1.288 |
| 12 | S11 | 3.4 | 9.07 | 1.405 |
| 13 | S12 | 4.3 | 14.51 | 2.681 |
2.1.3 突变菌株对小菜蛾的毒力作用
原始菌株S0及突变菌株S2、S4和S9处理的供试小菜蛾校正致死率分别为78.42%、85.25%、83.17%和82.67%；半致死时间分别为6.56、5.43、5.78和5.84 d（表3）；其中菌株S2处理的小菜蛾的校正致死率最高，且半致死时间最短，较原始菌株分别提高了8.7%和缩短了17.2%。表明突变菌株S2对小菜蛾的毒力效果最好。因此，选取S2突变菌株进行后续相关试验。
表3 突变菌株对小菜蛾的毒力作用 |
| 菌株 | 浓度/ （个/mL） | 校正致死率/% | 回归方程 | 决定系数/R 2 | 半致死时间/d |
|---|---|---|---|---|---|
| S0 | 1×107 | 78.42 | y=12.46x－30.43 | 98.53 | 6.56 |
| S2 | 1×107 | 85.25 | y=11.38x－11.80 | 97.82 | 5.43 |
| S4 | 1×107 | 83.17 | y=11.76x－17.97 | 98.76 | 5.78 |
| S9 | 1×107 | 82.67 | y=11.84x－19.15 | 98.04 | 5.84 |
2.1.4 S2突变菌株的遗传稳定性测定
突变菌株的遗传稳定性对其后续的生产利用具有重要的影响。通过对S2突变菌株进行连续5代的传代试验，其单位面积产孢量如表4所示。S2突变菌株的平均产孢量稳定在4.74×109个/cm2水平，表明其具有较好的遗传稳定性。
表4 突变菌株S2的遗传稳定性测定 |
| 传代次数/代 | 产孢量/（×109个/cm2） |
|---|---|
| 1 | 4.76±0.58 |
| 2 | 4.64±0.47 |
| 3 | 4.72±0.45 |
| 4 | 4.83±0.38 |
| 5 | 4.75±0.53 |
2.2 S2突变菌株的固态发酵单因素条件优化
2.2.1 培养基质比
2.2.2 硝酸钾含量
2.2.3 接种量
2.2.4 含水量
2.3 S2突变菌株发酵条件的响应面优化
2.3.1 响应面试验
S2突变菌株发酵条件的三因素三水平响应面试验结果如表5所示。采用Design Expert 8.0.6软件对表5中的试验结果进行回归分析，其回归模型分析结果见表6。结果表明，整体模型极显著（P=0.000 4）；其中麦麸和米糠基质比的一次项和二次项对产孢量的影响在0.01水平上均具有统计学意义；麦麸和米糠基质比与无机盐含量交互作用、无机盐含量与接种量交互作用、无机盐含量的二次方以及接种量的二次方对产孢量的影响在0.05水平上具有统计学意义。通过回归分析，得到以产孢量为响应值（Y）与麦麸和米糠质量比（A）、无机盐含量（B）、接种量（C）之间的回归方程式，Y=3.42－0.31A+0.034B－0.04C+0.13AB+0.061AC+0.15BC－0.40A2－0.14B2－0.16C2。
表5 响应面优化试验设计 |
| 试验号 | A | B | C | 产孢量/（×108个/g） |
|---|---|---|---|---|
| 1 | -1 | -1 | 0 | 10.08 |
| 2 | 0 | 0 | 0 | 12.30 |
| 3 | 1 | 0 | 1 | 7.00 |
| 4 | 0 | 0 | 0 | 11.37 |
| 5 | -1 | 0 | 1 | 9.63 |
| 6 | -1 | 0 | -1 | 10.10 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 10.93 |
| 8 | 1 | 0 | -1 | 6.13 |
| 9 | 0 | 1 | -1 | 9.53 |
| 10 | 0 | 1 | 1 | 10.07 |
| 11 | 1 | -1 0 0 0 0 0 0 1 1 -1 1 0 -1 -1 1 0 | 0 | 5.57 |
| 12 | -1 | 1 1 1 -1 1 0 -1 -1 1 0 | 0 | 9.84 |
| 13 | 0 | 0 0 | 0 | 11.37 |
| 14 | 0 | -1 -1 1 0 -1 -1 1 0 | 1 | 8.10 |
| 15 | 0 | -1 | -1 | 11.32 |
| 16 | 1 | 1 | 0 | 7.46 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 12.50 |
表6 回归模型分析 |
| 方差来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F | P | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 模型 | 1.92 | 9 | 0.21 | 18.54 | 0.000 4 | ** |
| A | 0.78 | 1 | 0.78 | 67.32 | < 0.000 1 | ** |
| B | 9.220E-003 | 1 | 9.220E-003 | 0.80 | 0.400 8 | |
| C | 0.014 | 1 | 0.014 | 1.23 | 0.303 5 | |
| AB | 0.068 | 1 | 0.068 | 5.88 | 0.045 8 | * |
| AC | 0.015 | 1 | 0.015 | 1.30 | 0.291 9 | |
| BC | 0.091 | 1 | 0.091 | 7.93 | 0.025 9 | * |
| A2 | 0.69 | 1 | 0.69 | 59.46 | 0.000 1 | ** |
| B2 | 0.078 | 1 | 0.078 | 6.80 | 0.035 0 | * |
| C2 | 0.11 | 1 | 0.11 | 9.87 | 0.016 4 | * |
| 残差 | 0.081 | 7 | 0.012 | |||
| 失拟项 | 0.042 | 3 | 0.014 | 1.46 | 0.351 9 | |
| 纯误差 | 0.039 | 4 | 9.633E-003 | |||
| 总误差 | 2.00 | 16 |
|
2.3.2 最佳培养条件的确定及验证
由上述回归模型可以得出，最优培养基配方为麦麸和米糠质量比为1.34∶1.00，无机盐含量为0.26%，接种量为9.32%，预测在此培养条件下的S2突变菌株产孢量为12.196×108个/g。在培养温度26 ℃，含水量50%的条件下，对上述优化的培养条件进行验证试验，三组平行试验得到S2突变菌株的产孢量平均值为11.762×108个/g，其与预测值拟合度达到96.44%，表明优化模型可靠。
3 结论与讨论
在工业生产上，生防制剂的生产需要考虑成本效益。本研究利用农业废弃物，如麦麸和米糠作为发酵培养基，不仅降低了生产成本，还促进了农业废弃物的资源化利用[18]。麦麸和米糠作为球孢白僵菌固态发酵培养基质的优势在于其富含淀粉和蛋白质，能够为微生物生长提供必要的碳源和氮源；另外，米糠还能改善发酵基质通气量，避免因麦麸加水后黏性过大而导致的发酵基质通气量不足，从而影响产孢量[19-20]。在固态发酵培养基中添加微量的硝酸钾，不仅调节了基质pH，还有效防止培养物基质的黏连，增加菌丝的生长空间[21]。然而，过高的硝酸钾含量会影响细胞的有丝分裂，从而影响菌丝的生长和产孢量[22]。接种量显著影响微生物进入对数生长期的速度，接种量不足会导致发酵时间延长，生产成本增加[11]；而接种量过大可能导致培养基质无法提供足够营养物质，从而减少孢子产量[23]。较低的基质含水量会降低营养物质传输，阻碍微生物生长，影响酶的稳定性和基质膨胀，进而影响真菌生长；而较高的含水量会导致发酵基质颗粒结块、通气不畅以及基质黏性增加，进而影响真菌的生长[24]。
本研究通过紫外诱变技术筛选出产孢量高、致病力强且遗传稳定的球孢白僵菌突变菌株S2，并对其进行固态发酵条件优化。该突变菌株的最佳固态发酵工艺条件为麦麸和米糠基质比1.34∶1.00，无机盐含量0.26%，接种量9.32%，含水量50%，培养温度26 ℃；在此条件下实际产孢量为11.762×108个/g。本研究结果为球孢白僵菌杀虫剂的生产提供了试验基础。