Isolation, screening, and characteristics of plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR） of Codonopsis pilosula

SHI Jing; CHEN Ruiling; LI Jianhong; JIANG Ming; CHEN Guangli; ZHAO Xiaoxia; YU Rui

doi:10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.07.023

Anhui Agricultural Science Bulletin >

2025 , Vol. 31 >Issue 7: 94 - 99

DOI: https://doi.org/10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.07.023

Isolation, screening, and characteristics of plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR） of Codonopsis pilosula

SHI Jing ¹^,² ,
CHEN Ruiling ¹ ,
LI Jianhong ³ ,
JIANG Ming ¹ ,
CHEN Guangli ¹ ,
ZHAO Xiaoxia ¹ ,
YU Rui ¹

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¹Department of Bioengineering, Liupanshui Vocational and Technical College, Liupanshui 553000, China
²Institute of Chemical Engineering, China University of Mining and Technology, Xuzhou 221000, China
³School of Life Science and Technology, Liupanshui Normal University, Liupanshui 553000, China

Received date: 2025-02-02

Online published: 2025-04-14

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Abstract

To explore the characteristics of rhizobacteria (PGPR) in Codonopsis pilosula, this study used the collected C.pilosula roots and their rhizosphere soil as experimental materials to isolate and screen PGPR. The strains were studied for their nitrogen fixation and potassium solubilization characteristics. Strains with obvious flora and rapid growth were selected to analyze their effects on the emergence rate, plant height, crown width, and other growth indicators of C.pilosula, and to classify and identify them. The results showed that a total of 23 PGPR strains were isolated from the rhizosphere of C.pilosula: 8 potassium-solubilizing bacteria, 7 nitrogen-fixing bacteria, 6 inorganic phosphorus-solubilizing bacteria, and 2 organic phosphorus-solubilizing bacteria. The distribution was mainly concentrated on the root surface, followed by the rhizosphere, and the least inside the root. In terms of characteristic, the strains with better growth were selected as Arp-2, Arp-3, Arp-7, Arp-16, and Arp-22. Arp-2 had the strongest organic phosphorus solubilization ability, which was 69.23 µg/mL. Arp-3 had the strongest inorganic phosphorus solubilization ability, which was 329.62 µg/mL. Arp-16 had the highest nitrogenase activity and potassium solubilization index, which were 841.77 nmol (C₂H₄)/(h·mL) and 3.66 mg/L, respectively. All 5 strains were inhibitory to Fusarium and Rhizoctonia solani pathogens. Among them, the Arp-7 strain had the highest inhibition rate against Fusarium, which was 90.54%. In terms of growth index, compared with the control, the emergence rate of C. pilosula increased by 4.96-17.70 percentage points after treatment with PGPR; plant height and crown width increased by 2.57-9.95 cm and 4.30-12.01 cm, respectively. After identification, among the 5 excellent strains, Arp-2 was identified as Pseudomonas thivervalensis, Arp-3 was identified as Bacillus amyloliquefaciens, Arp-7 was identified as Bacillus subtilis, Arp-16 was identified as Paenibacillus polymyxa, and Arp-22 was identified as Bacillus licheniformis. This study provides a reference for further analysis of the mechanism of PGPR and the development of functional microbial resources.

Key words： Codonopsis pilosula; plant growth-promoting rhizobacteria; phosphate-solubilizing bacteria; nitrogen-fixing bacteria; potassium-solubilizing bacteria

Cite this article

SHI Jing , CHEN Ruiling , LI Jianhong , JIANG Ming , CHEN Guangli , ZHAO Xiaoxia , YU Rui . Isolation, screening, and characteristics of plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR） of Codonopsis pilosula[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin, 2025 , 31(7) : 94 -99 . DOI: 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.07.023

党参具有润肺和增强免疫力等功效^[1]，被广泛应用于临床防病治病和日常健康饮食中^[2-3]。该作物栽培过程需肥量较大^[4-6]，且生长过程中病害较多，给党参的绿色高效栽培带来挑战^[7]。但长期不合理施肥，会造成土壤结构性差，土壤酶活性降低，有益微生物数量大量减少；导致作物产生抗药性，作物产量和质量下降^[8]。植物根际促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）的利用是解决这些问题的途径之一。

植物根际微生物系统可有效调节植物菌群结构，以增强植物抵抗力和耐受性^[9]。植物根际定殖的有益根际细菌被称为PGPR^[10]，能够产生激素且具备拮抗病原菌等功能^[11-12]，PGPR通过增强植物对土壤养分的吸收，促进固氮过程，以及动员关键养分（如磷、钾和铁）等，以提高作物产量，增强其抗逆性^[13]。陈燕鸿等^[14]以分离自海水稻根际土壤的15株细菌为材料，进行盐耐受性、降碱能力和促生特性测定，结果表明，PGPR及其复合菌群在盐胁迫条件下对绿豆种子萌发具有促进作用，且复合菌群效果优于单一PGPR；与对照组相比，复合菌群在盐浓度为15 g/L时作用效果较明显，提高绿豆各项指标（根长、发芽率和简化活力指数），相对盐害率从80.53%下降为18.95%，绿豆种子的耐盐阈值从10 g/L提高至15 g/L，说明复合菌群中各菌株在促进绿豆种子发芽中具有协同作用。卢明媚等^[15]研究表明，从牡丹根际土壤中筛选出8株多功能促生菌株，其中菌株N3、P2和N16兼具固氮、溶磷、产铁载体和分泌吲哚-3-乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）能力，且菌株N3分泌IAA含量最高。孟静等^[16]探讨植物根际促生菌DM11的促生长特性及所产挥发性物质（VOCs）对农作物生长的影响，并测定菌株促生长特性及对苗的促生长作用。李思思等^[17]研究表明，施用PGPR菌剂会降低植烟土壤的pH值，提高有效磷含量和固氮酶活性。梁卫驱等^[18]从葡萄根际土壤中分离出具有溶磷解钾功能的菌株F13，其发酵液灌根处理对豆角生长具有促进作用。高亚慧等^[19]分离获得的PGPR菌株GX14001，对本氏烟草和上海青均表现出显著促生效果。棉花内生细菌S258产生的VOCs对病原真菌具有抑制作用，并能促进拟南芥的生长^[20]。然而，促生菌对水分、温度和土壤等环境条件的依赖性较强，大部分外源功能菌在喀斯特地区土壤中的应用效果往往不理想。贵州是喀斯特地貌集中分布地区之一^[21]，该地区土层薄、成土速率缓慢、水土流失危险度较高，限制了党参生长与产能发挥。基于此，本试验对研究区党参PGPR进行分离筛选和特性研究，为党参高效种植提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区基本情况

采样区位于贵州省六盘水市大河镇周家寨，其属于贵州西南部，乌蒙山区，是典型的山地喀斯特地形，地处云贵高原一、二级台地斜坡上，境内岩溶地貌类型发育齐全。地势西北高，东南低，平均海拔1 800 ｍ，冬季平均气温为3 ℃，属北亚热带季风湿润气候，无霜期230～300 d，降水量1 200~1 500 mm，平均气温12 ℃^[22]。

1.2 样品采集与处理

2023年7月在党参种植研究区，采集长势旺盛、无病虫害的党参根及根际土壤，快速装入无菌样品袋中，用冰袋保存运回实验室。在实验室将土壤分成3个区域：根际土壤（Soil adhering to roots，RS）、根系表面（Rhizoplan or surface of roots，RP）与根内（Histoplan or interior of roots，HP）^[23]，之后进行分离纯化^[24-25]。

1.3 党参PGPR的分离与纯化

1.3.1 固氮菌的分离与纯化

选择NFM培养基用涂布平板法分离纯化固氮菌^[24-25]，重复3次，将培养基放在28 ℃的培养箱内培养，3 d后计数。

1.3.2 溶磷菌的分离与纯化

采用平板涂布法在PKO培养基、蒙金娜有机磷培养基^[24]表面分离纯化溶解无机磷菌株、溶解有机磷菌株。分别选择RS、RP与HP区域的10^-3、10^-4、10^-5稀释液50 μL进行接种^[26]，每个区域每个浓度重复3次实验，设置培养箱温度28 ℃，5 d后观察并计数。

1.3.3 解钾菌的分离与纯化

采用改良版亚历山大罗夫培养基^[25]，取100 μL稀释液涂布平板，28～30 ℃培养3～7 d，观察透明圈，挑取产生透明圈的菌落，进一步纯化。

1.4 菌株特性研究

从分离筛选的菌株中，挑选菌落明显、生长较快、D/d值（菌落周围能形成溶磷透明圈，溶磷圈直径Ｄ、菌落直径ｄ）大于1.5的菌株开展进一步研究。菌株固氮能力以固氮酶活性表示，用乙炔还原法测定^[24-25]；溶有机磷、溶无机磷能力采用钼蓝比色法^[26]；IAA分泌量用高效液相色谱法测定^[27]；原子吸收分光光度法测定解钾能力^[28]；病原菌的拮抗效果采用平板对峙法测定^[24-25]。

1.5 党参生长指标测定

用3 mm的土壤筛对混有蛭石的土壤进行筛分，辐照灭菌后装入直径20 cm、深18.5 cm已消毒的花盆备用。对种子进行消毒并观察党参发芽和出苗情况。选择15株长势一致的幼苗栽培观察，第7天留下10株长势一致的幼苗进行试验。将待测菌株活化，选择LB培养液进行接种，培养条件为28 ℃、180 r/min，灭菌的LB培养液作对照（CK），每株幼苗根部滴加2 mL菌株培养液。将试验幼苗定期浇水置于25 ℃、自然光下培养，第30天测定株高、冠幅。

1.6 菌株鉴定

采用芽孢染色、革兰氏染色观察菌落形态；用紫外分光光度法测定DNA纯度^[29]。参照李建宏等^[30]的方法进行PCR扩增，测序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.7 数据分析

数据整理采用Excel 2020软件，利用SPSS 21.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 党参PGPR的分离与纯化

由表1可知，从党参根际分离出23株PGPR，其中7株固氮菌、8株解钾菌、2株溶有机磷菌，6株溶无机磷菌。菌株分布在党参根际不同部位，固氮菌2株分布在根际土壤、5株分布在根系表面；解钾菌3株分布在根际土壤、4株分布在根系表面、1株分布在根内；溶有机磷菌1株分布在根际土壤、1株分布在根系表面；溶无机磷菌2株分布在根际土壤、4株分布在根系表面。总体来说，固氮菌、溶磷菌和解钾菌的分布主要集中在根系表面，根际次之，根内最少。

表1 PGPR在党参根际的分布 (株)

PGPR	总数	菌株分布数
PGPR	总数	RS	RP	HP
固氮菌	7	2	5	0
解钾菌	8	3	4	1
溶有机磷菌	2	1	1	0
溶无机磷菌	6	2	4	0

2.2 PGPR菌株的特性

2.2.1 促生特性

从党参根际分离出Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22共5株特性优良的菌株。由表2可知，3株具有溶有机磷能力，Arp-2的溶有机磷能力最强，为69.23 µg/mL；D/d值在1.29~1.71，Arp-2的D/d值高于Arp-3、Arp-7，差异具有统计学意义（P<0.05）。在无机磷培养基中Arp-3菌株的pH最低，为4.12，与其他4株差异具有统计学意义（P<0.05）；Arp-3溶无机磷能力最强，为329.62 µg/mL，高于Arp-2、Arp-7、Arp-16和Arp-22（P<0.05），D/d值表现为Arp-7最低，Arp-3最高。

表2 复筛菌株溶磷、固氮、解钾和分泌IAA特性

	无机磷			有机磷			固氮酶活性/ [nmol（C₂H₄）/ （h·mL）]	解钾指数/ （mg/L）	IAA/ （µg/mL）
菌株	D/d	pH	溶磷能力/ （µg/mL）	D/d	pH	溶磷能力（µg/mL）	固氮酶活性/ [nmol（C₂H₄）/ （h·mL）]	解钾指数/ （mg/L）	IAA/ （µg/mL）
Arp-2	1.59±0.03 d	4.33±0.05 d	259.57±2.69 c	1.71±0.11 a	4.49±0.07 b	69.23±1.45 a	/	3.09±0.21 b	71.26±0.85 a
Arp-3	1.97±0.12 a	4.12±0.10 e	329.62±5.62 a	1.31±0.09 b	4.22±0.01 c	55.37±1.51 b	74.21±3.25 d	2.88±0.16 c	52.36±0.91 b
Arp-7	1.12±0.12 e	5.32±0.13 a	52.32±2.29 e	1.29±0.02 b	4.68±0.03 a	39.26±0.65 c	574.23±19.25 b	2.41±0.14 d	36.33±0.52 d
Arp-16	1.84±0.09 b	4.55±0.11 c	133.59±6.95 d	/	/	/	841.77±22.17 a	3.66±0.22 a	44.85±0.92 c
Arp-22	1.74±0.07 c	4.79±0.14 b	275.14±3.95 b	/	/	/	255.83±19.65 c	2.01±0.09 e	21.28±0.18 e

注：/表示菌株未检测出该特性；同列不同小写字母表示差异在0.05水平具有统计学意义。

不同菌株之间固氮酶活性不同，其中Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22具有固氮酶活性，Arp-16固氮酶活性最强，为841.77 nmol（C₂H₄）/（h·mL），Arp-3固氮酶活性相对较弱，为74.21 nmol（C₂H₄）/（h·mL）。Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22的IAA分泌量在21.28～71.26 µg/mL，Arp-2的IAA分泌量最高，为71.26 µg/mL，与其余菌株差异具有统计学意义（P<0.05）。Arp-16的解钾指数最高，为3.66 mg/L。

2.2.2 病原菌拮抗效果

常见病原菌的拮抗效果如表3所示，针对常见病原菌镰刀菌、丝核菌，5株待测菌株Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22均具有一定的拮抗能力，其中Arp-7菌株对镰刀菌抑制率最高，为90.54%，Arp-2菌株抑制率最低，为55.33%；Arp-22菌株对丝核菌的抑制率最高，为80.64%，Arp-2菌株抑制率最低，为58.62%。总的说来，5株待测菌株相互之间的拮抗能力不同，同一菌株对不同病原菌的拮抗能力也不同。

表3 复筛菌株对常见病原菌的拮抗效果 (%)

菌株	镰刀菌	丝核菌
Arp-2	55.33±2.75 e	58.62±1.37 e
Arp-3	80.26±2.59 c	75.28±0.95 b
Arp-7	90.54±3.17 a	61.33±0.81 d
Arp-16	75.26±1.11 d	70.26±1.29 c
Arp-22	85.20±2.65 b	80.64±1.58 a

2.3 PGPR菌株对党参生长指标的影响

由表4可知，与CK相比，Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22菌株处理后，党参的出苗率提高了4.96～17.70个百分点、株高提升2.57～9.95 cm、冠幅增加4.30～12.01 cm，结果表明，用促生菌处理后，党参的出苗率、株高、冠幅等指标均有显著提升（P<0.05）；同时，Arp-22菌株对出苗率、株高、冠幅等促进效果最好。

表4 PGPR菌株对党参生长的影响

菌株	出苗率/%	株高/cm	冠幅/cm
CK	80.45±1.22 f	25.21±1.51 f	36.55±2.35 f
Arp-2	95.21±1.40 b	27.78±2.05 e	42.31± 1.50 d
Arp-3	92.26±1.20 c	31.20±0.85 c	45.88± 1.31 b
Arp-7	85.41±1.22 e	29.85±1.31 d	40.85± 1.50 e
Arp-16	90.45±2.50 d	33.24±0.81 b	43.59± 1.58 c
Arp-22	98.15±2.12 a	35.16±2.25 a	48.56± 2.01 a

2.4 PGPR菌株鉴定

本研究分离筛选的5株菌落形态和菌体形态各不相同，对菌株形态观察的结果显示，Arp-2菌落圆形凸起、边缘整齐、透明有光泽、表面光滑湿润，菌体G⁺、具荚膜、呈杆状，大小为0.8 μm×（1.5～2.5）μm；Arp-3菌落圆形、扁平、表面湿润、边缘较整齐，菌体G+、具中生芽孢，短杆状（0.7～0.9）μm×（1.8-3.0）μm；Arp-7菌落呈不规则圆形、边缘不整齐、表面粗糙不透明、污白色，菌体G⁺，具芽孢，呈杆状，（0.7～0.8）μm×（2.0～3.0）μm；Arp-16菌落白色、圆形、扁平、边缘整齐、表面光滑湿润有光泽，菌体G+、杆状、具芽孢，大小为（0.6～0.8）μm×（2.0～4.5）μm；Arp-22菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，菌体G+，具芽孢，呈杆状，0.8 μm×（1.5～3.5）μm。对本研究分离筛选出的5株菌株16S rRNA序列进行系统进化分析，可以初步确定Arp-2为赛维瓦尔假单胞菌（Pseudomonas thivervalensis），Arp-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），Arp-7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），Arp-16为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），Arp-22为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

3 结论与讨论

PGPR是一类定殖于植物根际土壤的有益细菌。接种PGPR能提高土壤中有效氮、有效磷等可吸收养分含量，促进植株对这些养分的吸收利用^[31]；也可增强植物自身免疫防御酶活性，提高植物对逆境的抵抗力^[32-33]。本研究从党参根际分离出23株PGPR，7株固氮菌、8株解钾菌、2株溶有机磷菌、6株溶无机磷菌；其中Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22的菌落明显生长较快。对常见病原菌镰刀菌、丝核菌，均具有一定的拮抗能力，其中Arp-7菌株对镰刀菌抑制率达90.54%，Arp-22菌株对丝核菌的抑制率达80.64%。与对照组相比，菌株Arp-2、Arp-3、Arp-7、Arp-16和Arp-22菌株提高了党参的出苗率、株高和冠幅，这与娄义等^[34]研究结论一致。分析原因可能是种子的萌发在一定程度上受到促生菌分泌的植物激素促进作用^[35-36]。PGPR促进植物生长主要途径：（1）通过产生ACC 脱氨酶减少乙烯水平的积累，并重新建立应对环境压力所需的健康根系^[37]；（2）PGPR通过产生不同的植物激素如IAA、GA（赤霉酸）和CTK（细胞分裂素）来改变根系构型，促进植物发育^[38]；（3）非生物固氮^[39]；（4）通过产铁载体、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶、抗生素、荧光素和氰化物等来增强对植物病原微生物的拮抗活性^[40]；（5）溶解磷和其他营养物质^[41]。PGPR促进植物生长是多种机制联合激活的结果。由此推测，党参种子发芽之后，菌株通过溶磷、产生植物激素、铁载体、诱导系统抗性或增加环境养分的利用率等途径，促进其幼苗的生长。

综上，本研究从党参根际中分离出23株具有促生作用的菌株，挑选出的5株优良菌株有不同程度的溶磷、固氮及分泌植物激素的能力，对常见病原菌镰刀菌、丝核菌，均具有一定的拮抗能力，均能提高党参出苗率、株高、冠幅，促进了研究区党参幼苗的生长；5株优良菌株中，Arp-2为赛维瓦尔假单胞菌（Pseudomonas thivervalensis），Arp-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），Arp-7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），Arp-16为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），Arp-22为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。本研究为研究区根际微生物进一步的深入研究和功能微生物资源开发提供参考。

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