烟草根黑腐病是一种烟草真菌病害，在烟草种植区域发生较普遍，且发生程度不一。因其具有土壤传播特性，该病害的侵染源较为复杂，导致其防治相对困难。尤其是随着各种植烟区烟粮间作套种模式的推广应用，使得烟草真菌病害的防治面临更加复杂的情况。
在烟草原料生产领域，生态烟草和绿色烟草的生产理念被普遍认同并付诸实践。生产上，根黑腐病等烟草真菌病害的防治已从化学防治转变为以生物防治为主导的防治模式。生物防治因其环境友好和安全性而具有明显优势，然而，其防治效果的缓慢性、实施条件的严格性以及功能菌株防效的衰减性，是当前普遍面临的现实问题。如宋玉娟等[1]研究发现，在温室盆栽试验条件下，棘孢木霉T-6对烟草根黑腐病的防治效果达75.14%；易龙等[2]研究表明，木霉菌TB72菌株对烟草根黑腐病病原菌菌丝生长和孢子萌发抑制效果显著，其在实验室条件下的防效达84.5%。因此，生物防治烟草根黑腐病在理论和实践上均具备可行性。持续开展烟草根黑腐病防治研究仍具有重要现实意义，尤其是针对生防微生物资源的筛选更新和生防菌功能条件的优化，这方面研究对生防菌剂的开发和田间应用指导起着关键作用。本研究从烟草根际土壤中筛选出一株烟草根黑腐病生防菌BM-03，并对其防效和发酵特性进行研究，为烟草根黑腐病生防菌剂的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
菌株分离土壤样品采自河南省驻马店确山县植烟区烟田；烟草根黑腐病病原菌茄镰孢菌（Fusarium solani）由河南科技大学园艺与植物保护学院提供；供试烟草品种为云烟87。
1.2 试验方法
1.2.1 菌株筛选
土壤样品按照常规平板稀释法进行平板培养，于28 ℃条件下恒温培养6 d，3次重复，观察记录菌落生长情况，并纯化保藏；采用平板对峙法进行生防菌筛选[3]。
1.2.2 烟草根黑腐病的盆栽防效验证试验
1.2.3 发酵特性分析
种子液的制备参考文献[6]所述方法，挑取菌饼接入液体培养基，制成种子液，备用。
1.2.3.1 单因素剔除试验
在微生物代谢过程中，不同碳源和氮源的利用效率存在差异。为探究不同碳源和氮源对产物产量的影响，设计单因素排除试验，分别配制排除单一碳源（可溶性淀粉）、氮源（KNO3）和无机盐（NaCl、MgSO4、FeSO4和KH2PO4）的发酵培养基，其他培养条件保持不变[7]。
1.2.3.2 发酵培养基优化
（1）碳源优化。分别以相同质量的果糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖和葡萄糖替代可溶性淀粉，配制不同碳源的培养基，其他条件保持不变，于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d，随后测定菌体质量浓度及抑菌活性。菌体质量浓度用质量/体积分数表示[8-9]。抑菌活性的测定采用牛津杯法进行对峙培养[10]。（2）氮源优化。分别以相同质量的蛋白胨、酵母粉、黄豆粉、尿素、NH4NO3和（NH4）2SO4替代KNO3配制培养基，其他条件保持不变。（3）氮源比例优化。将黄豆粉和酵母粉按4:1、3:2、2:3和1:4的比例配制培养基，其他条件保持不变。（4）正交试验。利用正交法[8-10]设计以碳源、氮源及浓度梯度二因素四水平正交试验。
1.2.3.3 发酵条件优化
（1）接种量。分别按 3%、5%、7%、9%、11%、13%、15%的接种量接入优化培养基，其他条件保持不变，确定最适接种量。（2）摇床转速。设置摇床转速为120、140、160、180、200、220 r/min，其他条件保持不变，确定最佳培养转速。（3）pH优化。调节培养基pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，其他条件保持不变，确定最适pH。（4）发酵温度。将发酵温度调节至22、25、28、31、34、37 ℃，其他条件保持不变，确定最佳发酵温度。（5）发酵时间。分别培养1～12 d，其他条件保持不变，确定最佳发酵时间。（6）装液量。在250 mL三角瓶中分别装入40、60、80、100、120、140 mL发酵液，其他条件保持不变，确定最适装液量。以上处理均设3次重复。
1.3 数据处理
采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，采用Excel软件作图。
2 结果与分析
2.1 烟草根黑腐病生防菌株的筛选
采用稀释涂布和平板对峙试验，从烟草根际土壤中分离得到1株拮抗烟草根黑腐病病原菌的菌株,编号BM-03。其抑菌圈直径为13.3 mm，抑菌率为52.78%。抑菌效果如图1所示。
2.2 菌株BM-03的生防效果
将烟株进行盆栽培养20 d后，先用烟草根黑腐病病原菌孢子悬浮液灌根处理，24 h后再用BM-03菌悬液处理。烟株生长40 d后进行调查，结果显示，接种BM-03菌株的烟株根系白嫩，根须发达，分支数量较多，地上生物量明显增加，整体生长状况良好，对根黑腐病的防治效果达78.03%；而未接种BM-03菌株的对照组烟株则表现出较严重的根黑腐病症状（图2）。
2.3 菌株BM-03的发酵特性
2.3.1 剔除试验
单因素剔除试验结果表明，剔除氮源（KNO3）和碳源（可溶性淀粉）对菌株BM-03的菌浓度和抑菌带宽的影响较大，而单因素剔除无机盐对菌株BM-03菌浓度和抑菌带宽的影响较小（图3）。
2.3.2 碳源筛选
不同碳源培养基中，可溶性淀粉最有利于菌株BM-03的生长（表1），显著高于其他处理（P<0.05）。因此，综合考虑选用可溶性淀粉作为最佳碳源。
表1 不同碳源对菌株BM-03发酵特性的影响 |
| 碳源 | 菌浓度/（g/L） | 抑菌带宽/mm |
|---|---|---|
| 可溶性淀粉 | 45.17±1.85 a | 12.85±0.30 a |
| 葡萄糖 | 18.12±0.33 c | 7.93±0.05 b |
| 麦芽糖 | 23.63±0.69 b | 8.35±0.02 b |
| 蔗糖 | 12.63±0.32 d | 7.05±0.04 b |
| 乳糖 | 17.86±0.22 c | 7.93±0.02 b |
| 甘露醇 | 19.48±0.41 c | 8.04±0.04 b |
|
2.3.3 氮源筛选
不同氮源处理中，酵母粉和黄豆粉更适合菌株BM-03的发酵，菌体浓度分别为78.52和71.06 g/L，抑菌带宽分别为15.77和15.29 mm（表2），显著高于其他处理（P<0.05）。综合考虑，选用酵母粉和黄豆粉作为菌株BM-03发酵培养的氮源组合。
表2 不同氮源对菌株BM-03发酵特性的影响 |
| 氮源 | 菌浓度/（g/L） | 抑菌带宽/mm |
|---|---|---|
| 酵母粉 | 78.52±0.50 a | 15.77±0.16 a |
| 蛋白胨 | 45.23±0.48 d | 13.07±0.03 b |
| 黄豆粉 | 71.06±0.59 b | 15.29±0.02 a |
| KNO3 | 52.03±0.44 c | 13.54±0.36 b |
| （NH4）2SO4 | 26.73±0.70 f | 9.14±0.45 d |
| NH4NO3 | 18.03±0.56 g | 7.75±0.27 e |
| 尿素 | 38.12±0.26 e | 12.34±0.29 c |
2.3.4 不同氮源比例筛选
由表3可知，菌株BM-03在黄豆粉和酵母粉比例为2:3和3:2时发酵获得的菌体较多，分别为83.17和81.07 g/L，抑菌带宽分别为15.86和16.45 mm。其中，3:2比例组合的菌浓度和抑菌带宽优于其他组合（P<0.05）。综合考虑，选用黄豆粉和酵母粉比例3:2作为氮源组合进行后续试验。
表3 不同氮源比例对菌株 BM-03 发酵特性的影响 |
| 黄豆粉:酵母粉 | 菌浓度/（g/L） | 抑菌带宽/mm |
|---|---|---|
| 4:1 | 71.67±0.64 c | 15.23±0.03 c |
| 3:2 | 81.07±0.65 a | 16.45±0.09 a |
| 2:3 | 83.17±0.42 a | 15.86±0.03 b |
| 1:4 | 75.98±0.66 b | 15.74±0.10 b |
2.3.5 正交试验优化结果
表4 菌株BM-03正交试验因素和水平 |
| 水平 | 因素A：可溶性淀粉（%） | 因素B：黄豆粉（%）+酵母粉（%） |
|---|---|---|
| 4:1 | 1 | 0.1 |
| 3:2 | 2 | 0.5 |
| 2:3 | 3 | 1 |
| 1:4 | 4 | 2 |
表5 菌株BM-03正交试验结果 |
| 试验号 | 因素A | 因素B | 菌浓度/（g/L） | 抑菌带宽/mm |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 1 | 57.82±0.53 e | 10.92±0.12 e |
| 2 | 1 | 2 | 64.93±0.82 d | 12.42±0.42 d |
| 3 | 1 | 3 | 70.17±0.23 d | 14.67±0.08 c |
| 4 | 1 | 4 | 76.83±0.86 d | 15.74±0.39 c |
| 5 | 2 | 1 | 82.19±0.48 c | 16.02±0.42 b |
| 6 | 2 | 2 | 95.34±0.75 c | 16.28±0.18 b |
| 7 | 2 | 3 | 101.64±0.22 b | 16.93±0.04 a |
| 8 | 2 | 4 | 103.21±0.73 b | 17.10±0.24 a |
| 9 | 3 | 1 | 105.78±0.71 b | 17.33±0.27 a |
| 10 | 3 | 2 | 109.42±0.62 a | 17.52±0.06 a |
| 11 | 3 | 3 | 116.87±0.84 a | 17.91±0.13 a |
| 12 | 3 | 4 | 115.37±0.41 a | 17.01±0.06 a |
| 13 | 4 | 1 | 117.31±0.77 a | 16.49±0.20 b |
| 14 | 4 | 2 | 111.24±0.42 a | 16.15±0.07 b |
| 15 | 4 | 3 | 102.38±0.33 b | 16.20±0.04 b |
| 16 | 4 | 4 | 96.42±1.22 c | 15.96±0.01 b |
| K 1 | 67.44 | 90.78 | ||
| K 2 | 95.60 | 95.23 | ||
| K 3 | 111.86 | 97.77 | ||
| K 4 | 106.84 | 97.96 | ||
| R | 11.11 | 1.80 |
2.3.6 培养基发酵条件优化
在发酵初期，接种量和转速对菌株BM-03菌体生长和抑菌带宽的影响不同，当接种量为7%时，菌浓度和抑菌带宽最大，分别为104.57 g/L和17.50 mm（图4A）；当转速为160 r/min时，菌浓度和抑菌带宽最大，分别为109.00 g/L和17.90 mm（图4B）；当pH在4.0～9.0时，菌株均能生长且有抑菌活性，当pH为8.0时，菌浓度较高且抑菌带宽最大，分别为115.01 g/L和17.74 mm（图4C）。当培养温度在28 ℃时，菌株BM-03生长最好，当温度低于22 ℃或大于37 ℃时，菌体生长受到抑制（图4D）。菌株在发酵第2～8天时菌体呈持续生长趋势，至第8天菌体生长量和抑菌带宽均达到最大，为124.28 g/L和18.76 mm，第10天开始下降（图4E）。在250 mL的三角瓶中，装液量为100 mL时菌浓度和抑菌带宽达到最大，分别为115.00 g/L和18.50 mm（图4F）。
3 结论与讨论
烟草作为一种特色经济作物，对植烟区烟农及地方经济具有较大影响。烟草病害的防治是提升烟草栽培管理质量的关键环节，也是影响烟草原料产量和品质的重要因素之一。在烟草生产中，生物防治烟草病害被广泛接受并付诸实践[11-12]。烟草根黑腐病作为一种土传病害，其发生及为害程度受多种因素影响，其致病病原菌种类繁多，其中茄镰孢菌（Fusarium solani）是较为常见的一种病原菌，其分布广且危害性大。在实际生产中，常采用生物防治配合栽培措施的方法来控制烟草根黑腐病，目前该病害的生防菌资源尚显单一[13-14]。本研究筛选得到的BM-03菌株对该病害具有较好的防治效果，盆栽验证试验条件下生防效果达78.03%，开发与应用潜力较大。功能菌发酵特性的研究是微生物资源开发与利用的关键环节[15-16]。通过发酵特性测定，无机盐对菌株BM-03发酵特性的影响较小，而可溶性淀粉、酵母粉和黄豆粉是该菌株生长发酵的适宜营养物质。优化后的最佳发酵条件为可溶性淀粉30 g，黄豆粉6 g，酵母粉4 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，总体积定容至1 L，并将 pH调节至8.0，接种量7%、装液量100 mL，于28 ℃恒温条件下进行培养。本研究对BM-03生防菌剂的开发及田间应用具有一定指导意义。