鹌鹑在饲养过程中易受到饲料中霉菌毒素的污染，在众多的霉菌毒素中，黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性较大，污染较为严重，AFB1通过采食进入机体后，会导致肝脏、肾脏出现损伤，同时伴随着动物机体抗氧化能力的下降，诱导氧化应激[1]。核因子E2相关因子2（Nrf2）是动物体内关键的抗氧化转录因子，可通过上调抗氧化相关基因的表达来缓解动物机体的氧化应激状态[2]。硒在动物机体中参与多种代谢途径，具有抗炎、抗氧化和拮抗重金属中毒等功能[3]。其无机、有机及纳米形式均被用作动物的饲料添加剂。此外，硒被广泛报道可作为对抗黄曲霉毒素的有效抗氧化剂[4]。
酵母硒（Yeast-selenium，Se-Y）是一种高吸收率的优质有机硒源。与无机硒相比，具有安全、稳定和易吸收等特点，其在动物营养中的作用逐渐被人们认识。此外，Se-Y具有较强的抗氧化和抗菌能力[5]。Shi等[6]研究表明，AFB1会干扰雏鸭的肝细胞线粒体，导致线粒体抗氧化功能障碍。Chen等[7]研究表明，饲粮中添加0.5 mg/kg的Se-Y可通过调节miR-26 a-5p/PTEN/PI3K/AKT信号通路拮抗镉诱导的鸡肾脏坏死性凋亡。然而，Se-Y能否缓解鹌鹑饲养过程中由于饲料AFB1超标造成的肝脏损伤尚未见报道。肝脏是动物机体重要的代谢、解毒器官，肝脏中涉及多种生物转化，因此，研究多集中于相关信号通路的转导与功能性拮抗剂的筛选。为模拟鹌鹑饲养过程中AFB1超标导致的肝脏损伤，本试验以鹌鹑肝脏为研究对象，利用AFB1诱导鹌鹑肝脏损伤构建AFB1暴露致肝脏损伤模型，并在此模型上探究Se-Y对AFB1致鹌鹑肝脏损伤的缓解效果，为Se-Y缓解鹌鹑饲料AFB1中毒提供参考。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
主要试剂：Trizol、RNA反转录试剂盒以及SYBR qPCR SuperMix试剂盒购自全式金生物科技有限公司；蛋白（TP）定量测定试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢（H2O2）以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）试剂盒均购于长春汇力生物技术有限公司。Se-Y购自安琪酵母股份有限公司，AFB1 标准物质：纯度>99%（青岛普瑞邦生物工程有限公司），多聚甲醛（武汉赛维尔生物科技有限公司）。
主要仪器：核酸定量分析仪NanodroPND1000（Thermo Fisher Scientific）、实时荧光定量PCR仪FQD-96A（linegene 9620杭州博日公司）、离心机1-16R（湖南可成仪器设备有限公司）、全自动生化分析仪DP180（广州东唐电子科技有限公司）、紫外可见分光光度计T6新世纪（北京普析通用仪器有限责任公司）、水浴锅HH-S4（常州国宇仪器制造有限公司）、万分之一天平JJ1023BF（常熟市双杰测试仪器厂）。
1.2 试验设计
试验在皖西学院实验动物房进行，试验动物批准编号为202205002，符合皖西学院动物伦理委员会的要求。将20日龄雌性黄羽鹌鹑分为A：对照组（基础日粮）、B：Se-Y组（0.8 mg/kg Se-Y）、C：AFB1组（30 μg/kg B.W AFB1）、D：Se-Y+AFB1组（0.8 mg/kg Se-Y+30 μg/kg B.W AFB1），每组10只，试验45 d。试验鹌鹑采用笼养方式，Se-Y采用饲料饲喂的方式进行，AFB1采用灌胃的方式进行。
1.3 鹌鹑肝脏的解剖学和组织病理学观察
试验最后一天染毒后禁食24 h，其间不禁水，麻醉后处死，立即取出肝脏。选取肝脏组织进行解剖学观察并拍照记录，随后将每只鹌鹑的肝脏样本分为3份，1份放入含4%多聚甲醛固定液中，通过脱水、透明、浸蜡，包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、HE染色、脱水、透明、封片等步骤进行组织病理学观察。1份放入EP管中用于组织匀浆；1份放入含有RNA保存液的EP管中，保存于-80 ℃冰箱，进行后续生物化学和分子生物学实验，包括氧化与抗氧化能力测定、Nrf2信号通路相关因子表达情况的测定。
1.4 鹌鹑血清生化肝功能指标
将采集的鹌鹑血液3 000 r/min，离心10 min；离心得到血清，利用全自动生化分析仪分析ALT、AST指标。
1.5 鹌鹑肝脏组织抗氧化指标测定
根据南京建成生物工程研究所蛋白定量测定试剂盒的使用说明书，将鹌鹑肝脏匀浆后使用TP检测试剂盒测定鹌鹑肝脏组织的蛋白浓度。T-AOC、GSH-PX、CAT、MDA、H2O2均参照试剂盒说明书进行测定和计算。
1.6 肝脏Nrf2抗氧化通路相关基因表达
采用Trizol法提取鹌鹑肝脏组织的总RNA，并使用核酸定量分析仪测定RNA样品的浓度与纯度。随后，按照全式金生物反转录试剂盒、SYBR qPCR SuperMix试剂盒的说明书进行RNA反转录合成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR。选择β-actin和GAPDH 作为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量。根据NCBI公布的基因CDS区设计引物，具体引物序列见表1，引物由擎科生物（杭州）股份有限公司合成。
表1 RT-qPCR引物信息 |
| 引物名称 | 引物序列（5'→3'） |
|---|---|
| β-actin | F:CATCAGGGTGTGATGGTTGGT R:GGGGTACTTCAGGGTCAGGA |
| GAPDH | F:CTTTCCGTGTGCCAACCC R:CAGCAGCCTTCACTACCCTC |
| Nrf2 | F:TTGGCAGAAGCATTCCCGTT R:CAATCTGATCGGGAACCAGT |
| HO-1 | F:ACTTCTATGGCAGCAACTGG R:AGGTCTCCCAAATAGCGAGT |
| NQO-1 | F:CTCCGAGTGCTTTGTCTACGA R:ATGGCTGGCATCTCAAACC |
| SOD-1 | F:TGTGCATGAATTTGGAGACAAC R:TTGCAGTCACATTGCCGAG |
| CAT | F:CAAGTTCCACGTTAAGACCGAT R:TAATCAGGATCAGTAGAAGCCAGT |
1.7 统计与分析
使用Graphpad prism 5.1对所有数据进行统计分析。使用One way ANOVA分析和Tukey的事后两两比较进行差异分析。
2 结果与分析
2.1 鹌鹑肝脏的解剖学观察
由图1可知，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其肝脏出现肿大、发黄、发白和易碎的现象。Se-Y组与对照组相比较肝脏的颜色无明显变化，与AFB1组比较，Se-Y+AFB1组肝脏颜色与Se-Y组和对照组相差较小。说明Se-Y可以缓解AFB1造成的组织损伤。
2.2 鹌鹑肝脏的组织病理学观察
对照组和Se-Y组肝细胞排列规则呈多边形、无肿胀和无变性等病理变化；AFB1组肝细胞索排列紊乱，肝细胞肿胀、空泡化变性，肝细胞索排列紊乱、胞核出现溶解甚至消失现象；Se-Y+AFB1组肝细胞肿胀、空泡化变性、肝细胞索排列紊乱现象较AFB1组有所减轻（图2）。这说明饲料中添加0.8 mg/kg的Se-Y可在一定程度上缓解AFB1导致的鹌鹑肝脏损伤。
2.3 鹌鹑血清生化肝功能指标
由图3可知，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其血清ALT、AST活性升高，差异具有统计学意义（P<0.001）；与对照组相比，Se-Y+AFB1组血清ALT、AST活性升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组血清ALT、AST活性明显降低，差异具有统计学意义（P<0.001）。这表明Se-Y可减轻AFB1暴露鹌鹑肝功能损伤。
2.4 鹌鹑肝脏组织氧化与抗氧化指标
由图4可知，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其肝脏组织中MDA、H2O2含量升高，差异具有统计学意义（P<0.001）；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏组织中MDA、H2O2含量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.001，P<0.05）。这表明Se-Y可减轻AFB1暴露导致的鹌鹑肝脏氧化损伤。
此外，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其肝脏组织中GSH-Px、T-SOD、CAT抗氧化物酶活性显著降低，差异具有统计学意义（P<0.001）；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏组织中GSH-Px、T-SOD、CAT的活性明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.001）。
与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其肝脏组织中T-AOC显著降低，差异具有统计学意义（P<0.01）；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏组织中T-AOC明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。上述结果表明Se-Y可通过激活抗氧化物酶的活性缓解AFB1导致的鹌鹑肝脏T-AOC水平降低，减轻AFB1所致的肝脏氧化损伤。
2.5 Se-Y拮抗AFB1对鹌鹑肝脏Nrf2抗氧化通路相关基因表达的影响
由图5可知，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，其肝脏组织中Nrf2的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义（P<0.001）；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏组织Nrf2的相对表达量明显升高，差异具有统计学意义（P<0.001）。这表明AFB1暴露可抑制Nrf2基因的表达，而Se-Y可减轻AFB1对Nrf2基因表达的抑制。
此外，与对照组相比，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，鹌鹑肝脏组织中Nrf2通路下游基因HO-1、NQO-1、SOD1、CAT的相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01，P<0.001）；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏组织中Nrf2通路下游基因HO-1、NQO-1、SOD1、CAT的相对表达量均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。这表明AFB1可抑制Nrf2信号通路下游基因的表达，而Se-Y可减轻AFB1对Nrf2信号通路相关基因表达的抑制。
3 讨论与结论
AFB1是一种霉菌毒素，存在于动物饲料中，易引起动物机体氧化损伤。鹌鹑在饲养过程中，摄入AFB1超标的饲料易导致机体抗氧化能力的下降[8]。硒是动物生物体内重要的微量营养元素之一，作为抗氧化剂，其可以通过清除氧自由基来保护组织和器官免受氧化损伤[9]。本研究中，AFB1处理后的鹌鹑肝脏出现明显肿大、发黄等现象；肝细胞出现索排列紊乱，肝细胞肿胀、空泡化变性，胞核溶解甚至消失等现象。与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组肝脏颜色与Se-Y组和对照组相差较小；肝细胞肿胀、空泡化变性、肝细胞索排列紊乱现象较轻。这表明AFB1暴露可导致肝脏脂质代谢障碍，进而发生脂质沉积，而Se-Y可在一定程度上缓解AFB1暴露导致的鹌鹑肝脏脂质代谢障碍。血清生化结果显示，当鹌鹑连续45 d摄入30 μg/kg B.W AFB1时，鹌鹑血清ALT、AST活性显著升高；与AFB1组相比，Se-Y+AFB1组血清ALT、AST活性明显降低，这表明Se-Y可减轻AFB1暴露导致的肝功能障碍，与Liao等[10]研究结果一致。
动物机体的抗氧化防御系统主要由抗氧化酶组成，包括SOD、CAT、GSH-Px等[11]，对维持动物机体的氧化平衡至关重要。SOD能够通过歧化反应清除自由基[12]。CAT可催化H2O2分解为水和氧气，并提高GSH-Px的活性[13]。GSH-Px是一种含硒酶，能够清除多余的H2O2 [14]。AFB1可诱导肝脏组织中MDA的积累，降低其抗氧化能力，导致鸭肝脏溶酶体损伤[15]。Guo等[16]研究指出，2.8 mg/kg AFB1处理鸡33 d后，鸡肝脏MDA含量升高、炎症介质的产生增加以及凋亡细胞数量增加，Nrf2信号通路被抑制。与已有研究结果相似，本研究中，AFB1组T-SOD、CAT、GSH-Px活性均显著降低，氧化产物MDA和H2O2含量增加，这表明AFB1暴露会引起鹌鹑肝脏的抗氧化能力下降，导致氧化损伤。Se-Y作为一种有机硒被广泛应用于动物生产过程中，Wang等[17]研究指出，Se-Y可通过抑制镉暴露导致的鸡肝脏中SOD、GSH-Px和CAT的活性的降低，减轻肝脏氧化应激及坏死性细胞凋亡。Sun等[18]研究指出，日粮中添加0.5 mg/kg的硒可通过上调编码抗氧化蛋白基因的表达量来提高抗氧化能力，从而保护雏鸡免受AFB1诱导的肝损伤。在本研究中，Se-Y+AFB1拮抗组缓解了AFB1导致的鹌鹑肝脏T-SOD、CAT、GSH-Px活性降低及氧化产物MDA和H2O2的积累，这表明Se-Y可减轻AFB1暴露鹌鹑肝脏氧化应激。
Nrf2作为抗氧化的重要的转录因子，在缓解氧化应激和减轻炎症反应方面起着重要的作用[19]。Nrf2的抗氧化功能包括增加GSH-Px的合成及下游基因NQO-1和HO-1的表达，以及提高抗氧化酶的活性[20]。Jin等[21]研究表明，AFB1可通过抑制Nrf2-ARE信号通路和激活NF-κB信号通路导致回肠损伤。本研究发现AFB1暴露后，鹌鹑肝脏 Nrf2信号通路相关抗氧化基因（Nrf2，HO-1，NQO-1，SOD1，CAT）的表达受到明显抑制。这进一步表明鹌鹑肝脏氧化应激模型的成功构建，也验证了在鹌鹑日粮中添加Se-Y来拮抗AFB1暴露致使鹌鹑肝脏氧化应激现象的可行性。动物饲料添加有机和无机形式的硒均能有效缓解AFB1的肝脏毒性[22-23]。其通过上调和激活Nrf2信号传导来发挥其抗氧化功能[24]。硒可上调Nrf2的表达，抑制NLRP3炎性小体的激活，并通过调节Nrf2-NLRP3通路来预防阿霉素诱导的心脏毒性[25]。而在本试验中，Se-Y+AFB1组中Nrf2信号通路相关基因的表达量较AFB1组有所增加，这表明Se-Y可通过激活Nrf2信号通路相关基因的表达来拮抗AFB1暴露致鹌鹑肝脏氧化损伤。T-AOC是反映机体抗氧化能力的综合性指标[26]。Zhang等[27]研究发现，Se-Y可通过激活Nrf2介导的抗氧化防御系统抑制活性氧（ROS）和MDA的产生、提高T-AOC和SOD活性来改善镉诱导的肝细胞损伤。本研究中，与AFB1相比，Se-Y+AFB1组鹌鹑肝脏总抗氧化能力显著升高，表明Se-Y在AFB1诱导的鹌鹑肝脏氧化应激中具有抗氧化作用，但具体的作用机制仍有待研究。
综上，本研究通过建立AFB1致鹌鹑肝脏损伤模型，验证Se-Y的拮抗作用，结果表明，AFB1暴露诱导鹌鹑肝脏氧化应激，抑制Nrf2信号通路相关因子的表达，导致肝脏损伤，而Se-Y通过增强Nrf2相关因子的表达及激活抗氧化物酶活性来拮抗AFB1所诱导的鹌鹑肝脏氧化损伤。以上结果表明，在鹌鹑实际饲养过程中可以适当添加Se-Y来拮抗AFB1暴露导致的鹌鹑肝脏损伤，但具体拮抗机制仍需进一步研究。