石耳[Umbllicaria esculenta （Miyoshi） Minks]分布广泛，主要分布于安徽、浙江等地区。石耳单片型，体扁平，幼小时正圆形，长大后为椭圆形或稍不规则，革质。裂片边缘浅撕裂状；上表面褐色，近光滑，局部粗糙无光泽，或局部斑点脱落而露白色髓层；下表面棕黑色至黑色，具细颗粒状突起，密生黑色粗短而具分叉的假根，中央脐部青灰色至黑色[1-2]。黄山石耳是一种生长在安徽黄山悬崖峭壁和阴湿石隙中的地衣门物种。主要分布于黄山市歙县一带以及休宁县西部山区，野生资源极为稀少[3]。石耳具有一定的食用价值和药用价值，其性质甘平无毒，能明目益精；还可以产生许多有益的代谢产物，具有抗菌、抗炎和抗氧化等作用[4-6]。石耳的代谢产物主要来源于石耳中的内生真菌。石耳在自然状态下生长缓慢，无法快速生产大量的石耳代谢产物用于药物开发。因此，相关研究人员通过人工培养方法来分离获得地衣内生真菌和其代谢产物。
Yamamoto等[7]提出地衣型真菌的分离培养方法，命名为Yamamoto法。相关研究人员对该分离方法进行了不断改进[8-10]。然而，采用Yamamoto法培养时步骤繁琐，并且分离培养后的菌株并不能严格区分表生菌、共生菌和内生菌，不利于高效获得地衣真菌资源。邱振鲁[11]通过改进Yamamoto法发明了刮皮层法，改进方法的真菌萌发率为71.5%，杂菌污染率为7.14%。尽管目前对地衣真菌的分离培养研究较多，刮皮层法仍然是其分离培养的主要方法[12]。不同的地衣菌结构有所不同，因此内生真菌的分离方法也不尽相同。本文在刮皮层分离培养法基础上，结合石耳的结构特征，改进一种石耳内生真菌分离方法——刮切法，并创新了研旋法分离技术，通过试验比较分析两种方法与刮皮层法分离培养的黄山石耳内生真菌的萌发率，筛选最佳分离方法，为黄山石耳内生真菌的大规模分离培养和代谢产物药物开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
分离培养材料为2022年10月采自黄山的12份标本，经鉴定为石耳[Umbllicaria esculenta （Miyoshi） Minks]。地衣内生真菌的培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato dextorse agar medium，PDA），组成成分为琼脂18 g，葡萄糖20 g，去离子水1 000 mL。
1.2 试验设计
本研究采用刮皮层法、刮切法和研旋法3种方法对黄山石耳内生真菌进行分离培养。刮皮层分离方法参考文献[9]。
1.2.1 刮切法
在新鲜的石耳地衣体中央取一小块（约2 cm×2 cm）组织，用刀片在解剖镜下小心除去其背面附着的土壤、假根等各种杂质，且将下表面的假根去除，注意避免伤及髓层部分。用小水流分别冲洗地衣体正反面各3～5 min，以冲掉地衣体表面附着的杂质。将地衣体放进超净台，紫外线照射地衣体上下表面各15 min，杀灭表面残存的杂菌。将刀片放置在火焰上灼烧灭菌，冷却后，刮去地衣体皮层（可以滴加1~2滴无菌水湿润地衣以方便刮取地衣），每刮一刀后，用无菌纱布仔细擦拭刀片。待髓层露出白色菌丝块时，切取约1 mm×1 mm的完整菌块。重复操作，直到取够至少30块菌丝髓层碎片。将切取下的菌丝块用无菌蒸馏水冲洗后放入已准备好的载有无菌水的擦镜纸上，使菌丝块通过表面张力悬浮在无菌水中。将冲洗后的菌丝块白色髓层朝向培养基接种至PDA培养基斜面中，分5批进行，每批接种14支试管，每支试管分开接种2个菌丝块，共接种70管，140个接种点，并做好标记。
1.2.2 研旋法
取地衣体叶片约1 cm×1 cm，用镊子及刀片去除其表面附着的杂质，并将下表面的假根切除，将假根处清理平整，切勿污染髓层。将地衣体叶片置于滤筛中固定，用手轻轻揉搓石耳体，特别是假根处，揉搓后的石耳体缓水流冲洗30 min，冲洗过程中将地衣体腹面置于自来水下，且不得偏离水柱。将冲洗完的地衣体放入超净工作台中，紫外线照射地衣体上下表面各15 min。将消毒后的石耳体置于蒸馏水中充分振荡冲洗后备用。灭菌结束后在超净工作台中用酒精灯略微烘烤后去除下皮层假根残面。将石耳体的上皮层用刀片轻轻去除，使白色髓层暴露出来。将露出白色髓层的石耳部分切下放在1.5 mL离心管中，加入无菌水，离心振荡冲洗后再放入无菌研钵中，加少许蒸馏水研磨均匀。用筛孔为500和150 μm的筛子对研碎后的地衣体碎片用无菌水进行过滤，将留在500 μm筛面上的碎片丢弃。用接种环挑起少量留在150～500 μm筛面上的白色地衣体碎片，放入装有1.5 mL无菌蒸馏水的离心管中，振荡混合均匀。当髓层碎片在离心管中处于悬浮状态时，迅速倒入PDA培养基中。旋转培养基，使碎片液体均匀覆盖在培养基表面。分5批进行，每批接种14个培养皿，每个培养皿分开接种2个菌丝块，共接种70个培养皿，140个接种点。并做好标记。
1.3 试验方法
将3种分离方法得到的石耳真菌接种于培养基中覆保鲜膜，倒置于25 ℃培养箱中，避光培养14 d，培养结束后，观察3种分离方法得到的黄山石耳内生真菌的菌落形态和萌发数；计算其总萌发率。
1.4 数据处理
采用Excel软件对数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 菌落形态
由图1可知，3种分离方法培养得到的黄山石耳内生真菌菌落形态差异较大。在相同的培养时间里，刮切法接种培养的菌落面积比刮皮层法分离培养的菌落面积明显偏大；研旋法因地衣体碎块接种在培养皿中，同一条件下无法比较菌落大小，但并不影响萌发率统计。
2.2 菌落萌发情况
由表2可知，刮皮层法、刮切法和研旋法得到的内生真菌萌发率分别为47.86%、65.00%和52.14%。由此可见，在相同的培养条件下，不管是刮切法还是研旋法，其分离培养的黄山石耳内生真菌的萌发率均高于刮皮层法。
表2 菌落萌发情况 |
| 批次 | 接种试管数 | 接种点 | 萌发数 | 总接种数 | 总萌 发数 | 总萌发率/% | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 刮皮层法 | 1 | 14 | 28 | 14 | 140 | 67 | 47.86 |
| 2 | 14 | 28 | 11 | ||||
| 3 | 14 | 28 | 17 | ||||
| 4 | 14 | 28 | 13 | ||||
| 5 | 14 | 28 | 12 | ||||
| 刮切法 | 1 | 14 | 28 | 15 | 140 | 91 | 65.00 |
| 2 | 14 | 28 | 19 | ||||
| 3 | 14 | 28 | 18 | ||||
| 4 | 14 | 28 | 20 | ||||
| 5 | 14 | 28 | 19 | ||||
| 研旋法 | 1 | 14 | 28 | 14 | 140 | 73 | 52.14 |
| 2 | 14 | 28 | 11 | ||||
| 3 | 14 | 28 | 18 | ||||
| 4 | 14 | 28 | 16 | ||||
| 5 | 14 | 28 | 14 | ||||
3 结论与讨论
利用Yamamoto法和改进的刮皮层法分离获得地衣共生菌藻资源，相关研究集中在共生菌藻的活性数据，对于其成功率和杂菌污染率的关注相对较少[13]。地衣体通常由上皮层、藻层、菌丝髓层和下皮层4个部分组成，其表面附着大量的微生物，特别是下皮层[14]。在地衣真菌的剥离培养过程中，确保实验的无菌性是关键，包括实验的无菌操作和适当的石耳表面灭菌。在本研究中，刮皮层法得到的黄山内生真菌培养萌发率最低，相较于刮切法和研旋法的操作步骤，可能是因为刮皮层法仅将石耳的上皮层刮去至露出髓层，在挑取髓层菌丝的过程中可能挑取到了下皮层上附着的杂菌，从而加大了杂菌污染率，降低了内生真菌的萌发率。与刮皮层法相比，刮切法不仅将黄山石耳地衣体的上皮层刮去，还将其附着较多微生物的下皮层及假根一并去除，极大降低了挑取菌丝的过程中附着大量微生物的下皮层的污染概率，能够得到比刮皮层法更洁净的髓层，因此刮切法分离获得的内生真菌的萌发率高。同时，刮切法将髓层切成约1 mm×1 mm碎块，使其操作更方便，降低操作过程中其他菌类污染的概率。研旋法是将黄山石耳地衣体的上下皮层和假根都刮去，与刮切法具有一定的相似性，但实际分离培养得到的内生真菌萌发率比刮切法低。可能是因为在分离过程中，酒精灯的使用，破坏了部分石耳内生真菌活性。此外，在研磨操作过程中，可能增加了与杂菌的接触机会，导致内生真菌的萌发率低于刮切法。
综上，本研究比较了刮皮层法、刮切法和研旋法3种方法分离得到的石耳真菌的菌落形态和萌发率，刮切法和研旋法分离培养的石耳真菌萌发率均高于刮皮层法。刮切法和研旋法均将地衣体的上皮层刮去，同时将附着大量微生物的下皮层及假根一并刮去，在挑取菌丝的过程中，减少了可能采集到下皮层上附着的其他微生物。实际操作过程中，使用这两种石耳真菌分离法在操作中应注意以下要点。第一，在刮切去上下皮层和假根时，刀片只能往一个方向刮切，不能将触及皮层的刀刃面触碰髓层部分；第二，每刮取一下，要用无菌纱布擦拭刀片。研究结果为石耳内生真菌大批量人工培养，开展石耳真菌代谢产物药品研发提供参考。