兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）是目前透明质酸（Hyaluronic acid，HA）工业化生产中最重要的微生物菌种[1-2]。该菌能够高效合成由N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接而成的高分子量HA多糖[3]。利用该菌株进行发酵生产具有无动物源成分污染风险，且易于规模化生产等优势。然而，用来生产透明质酸的兽疫链球菌因自身的三羧酸循环不完全，有多种氨基酸不能自身合成，因此其对培养基的营养成分要求较高，尤其是碳源和氮源[4]。许浩等[5]和朱丽雅等[6]研究发现，链球菌的实验室培养一般以碳源、氮源、氨基酸、维生素、无机盐和生长因子等为发酵培养基。本研究通过改变培养基不同的碳源、氮源对兽疫链球菌进行发酵培养，以确定兽疫链球菌最佳培养碳源和氮源，为兽疫链球菌工厂化发酵培养和高效生产HA提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
兽疫链球菌，由信阳农林学院微生物实验室提供。碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、半乳糖、麦芽糖和红糖。氮源：酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、大豆粉、（NH4）2SO4。均来自市售。
1.2 试验仪器
XFH-30CA立式高压蒸汽灭菌锅，杭州亚旭生物科技有限公司；TG16G高速台式离心机，上海北弘仪器有限公司；D106B显微镜，济南欧莱博技术有限公司；THZ-98A恒温摇床，杭州绿博仪器有限公司；DZF-6020A真空干燥箱，绍兴尚诚实验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 培养基的制备
（1）种子培养基：葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，氯化钠0.2 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，琼脂粉1.5 g，微量元素液1.0 mL，缓冲液40.0 mL，蒸馏水100 mL，调pH至7.0，121 ℃高压灭菌30 min。（2）固体培养基：葡萄糖0.5 g，蛋白胨1.0 g，酵母膏0.5 g，氯化钠0.2 g，琼脂粉1.5 g，蒸馏水100 mL，调pH至7.0，121 ℃高压灭菌30 min。固体培养基冷却至50 ℃加入脱脂羊血10.0 g，制成血液固体培养基。（3）发酵培养基：葡萄糖2.0 g，酵母膏1.0 g，蛋白胨1.0 g，氯化钠0.2 g，MgSO4·7H2O 0.03 g，蒸馏水100 mL，调pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。（4）液体培养基：葡萄糖1.0 g，蛋白胨1.0 g，KH2PO4 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，酵母膏0.5 g，蒸馏水100 mL，调pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。
1.3.2 菌种的纯化
1.3.3 碳源对兽疫链球菌生长的影响
1.3.4 氮源对兽疫链球菌生长的影响
取不同氮源[酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、玉米浆干粉、大豆粉、（NH4）2SO4）]2.00%，MgSO4·7H2O 0.03%，葡萄糖2.00%，KH2PO4 0.20%，溶液的pH调节到7.0，接种量为10%，37 ℃，200 r/min培养16 h，以不加氮源的培养基为对照。分别各取1%两种不同的氮源，其余条件一致进行混合氮源培养。
1.3.5 产量测定
培养结束后，将发酵菌 4 000 r/min离心15 min，弃上层清液，菌体沉淀蒸馏水清洗两遍，然后放到真空干燥箱内进行干燥，干燥后称重，记为产量。
1.3.6 兽疫链球菌菌株形态学特征
利用革兰氏染色观察菌株形态，将生理盐水滴于载玻片中央，用接种环挑取少许兽疫链球菌于水滴中，涂成薄膜状，经2～3次火焰进行固定，固定后结晶紫染色1～2 min，缓水流冲洗，再用碘液覆盖约1 min，缓水流冲洗，滤纸吸取残水后用95％乙醇脱色，番红复染2 min，最后用缓水流冲洗，干燥后油镜观察。
2 结果与分析
2.1 单一碳源对兽疫链球菌发酵生长的影响
由图1可知，无碳源的情况下兽疫链球菌产量为0.91 g/L，几乎不生长；兽疫链球菌对红糖和葡萄糖的利用能力较强，其产量分别为5.13和4.86 g/L，其次是蔗糖和麦芽糖，最后是果糖、半乳糖和木糖。出现这种情况可能与兽疫链球菌对不同碳源的吸收转化利用的方式有关，吸收蔗糖会被转化成葡萄糖进行利用，而像麦芽糖这类则需要更加复杂的过程进行吸收转化利用，因此用麦芽糖这类物质做碳源时菌的产量较低。
2.2 混合碳源对兽疫链球菌发酵生长的影响
红糖的成分复杂，而兽疫链球菌对木糖的吸收利用能力较差，因此在混合碳源中暂不考虑红糖和木糖。由图2可知，葡萄糖和蔗糖混合组的兽疫链球菌产量最多，为4.78 g/L，比单一碳源葡萄糖下产量少，这可能是兽疫链球菌分解蔗糖转化成葡萄糖，所以含有蔗糖和葡萄糖组的菌产量比其余组高；在条件相同的情况下，兽疫链球菌在混合碳源中没有单一碳源下生长得好。由此可见，菌的产量并没有随碳源种类的增加而增加。
2.3 单一氮源对兽疫链球菌发酵生长的影响
由图3可知，在没有氮源和无机氮（NH4）2SO4的条件下，兽疫链球菌产量较少，说明无机氮源不能为兽疫链球菌生长提供所需氮源。采用有机氮源时，酵母膏作为氮源时兽疫链球菌的产量最高，为4.86 g/L，其次是玉米浆干粉和大豆粉，然后是牛肉膏和蛋白胨，这可能是因为酵母膏内含有的营养物质比其他氮源多，菌产量较高。
2.4 混合氮源对兽疫链球菌发酵生长的影响
2.5 兽疫链球菌菌株形态学特征
3 结论与讨论
碳源是兽疫链球菌生长和代谢的主要能量来源，其类型和浓度直接影响菌的生长速率。氮源为微生物的生长提供必需的氮元素，同时提供多种对于微生物生长至关重要的生长因子，有助于促进微生物的代谢和繁殖。根据来源，氮源可以被进一步划分为有机氮源和无机氮源，各自具有不同的特性和功能，为微生物的营养需求提供了多样化的选择。在本研究中，兽疫链球菌在缺乏碳源的环境中几乎无法生长，在仅含葡萄糖这一单一碳源的条件下，其生长状况较佳，产量为4.86 g/L。这与Zhang[13]等的研究结果相符。在氮源的筛选试验中发现，兽疫链球菌在无氮源或仅添加无机氮源的环境中几乎不生长。当培养基中添加酵母膏作为单一氮源时，兽疫链球菌的产量较高，为4.86 g/L，这与Wang[14]等的研究结果相符。当酵母膏与蛋白胨混合使用时，兽疫链球菌的产量进一步提升至5.14 g/L。在多重混合氮源组中，酵母膏、牛肉膏和蛋白胨的混合使用，兽疫链球菌的产量最高，即5.33 g/L，这表明多重混合氮源的使用能够提高兽疫链球菌的产量，其效果优于单一氮源或简单的混合氮源。
综上，本试验研究了不同碳源和氮源对兽疫链球菌的生长的影响，结果表明，葡萄糖作为单一碳源对兽疫链球菌的生长最为有利，碳源的混合使用并不适合兽疫链球菌的生长；而酵母膏作为单一氮源表现出良好的促生效果，氮源的混合使用比单一氮源具有更优的生长效果。本研究为进一步优化链球菌繁殖条件提供参考，在实际生产中，可以根据本研究结果调整种子培养基的成分，以提高链球菌的生长性能。此外，鉴于不同碳和氮源对微生物生长的不同影响，可以补充研究更多类型的碳和氮源，以及其之间的相互作用，探索更高效的兽疫链球菌培养方式。