脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）为黄杆菌科（Flavobacteriaceae）、伊丽莎白菌属（Elizabethkingia）[1]，在自然环境（淡水、海水和土壤）中分布较广泛。感染E. meningoseptica可能导致新生儿脑膜炎、成人败血症等[2-4]。Xie等[5]和Ransangan等[6]在牛蛙中检测到E. meningoseptica，对两栖动物产业造成了一定的经济损失[5-6]。该菌对β-内酰胺类抗生素具有较高的抗性，这与菌株携带β-内酰胺酶（MBL）家族基因（blaB和blaGOB）有关[7]，Colapietro等[8]研究发现，携带MBL基因的菌株可通过产金属MBL的方式发挥抗β-内酰胺类抗生素的作用。黑斑蛙具有捕食害虫的能力和药用价值[9]。本研究对某黑斑蛙养殖场流行性疾病进行调查，检验其主要病原体，并检测了该菌株的耐药基因以及抗菌药物敏感性，为其临床防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
病蛙为湖南岳阳某养殖场自然发病黑斑蛙，用于采集病料和致病菌分离培养。BHI培养基购自海博生物技术有限公司；药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒和DL 2 000DNA Maker和DL 1 000DNA Maker购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR及相关试剂购自成都擎科梓熙生物技术有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 发病情况调查及临床病变观察
2024年8月，某黑斑蛙养殖场发生了流行性疾病，现场选取了该发病区2个养殖户的患病蛙，剖检濒死且具有典型症状的患病蛙各5只，正常蛙3只。对患病蛙的临床病变进行解剖观察，采集组织用于实验室病原分离鉴定和病理组织学观察。
1.2.2 病理组织学观察
采集自然发病蛙的肺脏、肾脏、脾脏、脑、眼及肌肉等组织，置于盛有10%中性福尔马林固定液的样品瓶中，做好样品标记，24 h后更换一次固定液，石蜡包埋切片，苏木素伊红（HE）染色，树胶封片，采用Nikon55i显微镜镜检观察组织病变，拍照。
1.2.3 细菌分离纯化
（1）细菌接种。对病蛙进行体表消毒，灼烧剪刀和镊子，进行无菌剖检，对内脏表面进行灭菌处理，用剪刀在器官表面划一小口，用灼烧冷却后的接菌环穿刺病灶较为明显的内脏组织，以分区划线的方法接种于BHI琼脂培养基，记录被检材料及日期，24 h内带回实验室，在28 ℃温箱中有氧培养18～24 h，观察菌落生长情况。（2）培养纯化。分别挑取各组平板上疑似菌落，革兰氏染色观察细菌形态及纯度，并采用分区划线的方法接种于BHI培养基，在28 ℃温箱中有氧培养18～24 h，直至得到纯的病原菌，纯化菌株用甘油保存。
1.2.4 细菌鉴定
接种环挑取纯化的细菌菌落，无菌接种于BHI液体培养基，于28 ℃培养箱中，150 r/min振荡培养18～24 h。取扩大培养的菌液2 mL，采用细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取细菌基因组DNA，以此为模板，采用细菌16 S rDNA和gyrB基因通用引物进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系：Premix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR循环参数设置：94 ℃，预变性5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，循环扩增30次；72 ℃，延伸10 min。以1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将预期片段PCR产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。将所测得的序列在NCBI网站中进行对比，构建系统进化树，确定菌株分类和进化地位。
表1 细菌16S rDNA和gyrB基因通用引物 |
| 引物名称 | 序列（5’—3’） | 退火温度/℃ | 预期大小/bp |
|---|---|---|---|
| 16S-F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG | 56 | 1 500 |
| 16S-R | TACGGCTACCTTGTTACGAC | ||
| gyrB-F | GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAY GCNGGNGGNAARTTYGA | 56 | 1 200 |
| gyrB-R | AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC RTCNACRTCNGCRTCNGTCAT |
1.2.5 药敏试验
（1）药敏纸片扩散法。选用庆大霉素、卡那霉素等20种药物，采用划线法对分离的细菌进行药敏试验。在无菌操作台内，分别挑取病蛙体内分离的细菌接种于新的BHI平板，贴上药敏纸片，28 ℃培养18～24 h后观察并测量抑菌圈直径，根据药敏纸片抑菌范围确定药物敏感情况。（2）牛津杯法。选取5份抗菌肽样品，分别编号T1（太轻松W）、T2（太轻松）、T3（常康健）、T4（多肽菌素）、T5（富利肽），常温保存于实验室。精确称取上述5份样品1 g，加入10 mL灭菌水，轻轻混合，置于摇床30 ℃，150 r/min振荡溶解30 min。10 000 r/min离心3 min，在超净台内用无菌注射器吸取适量上清液，0.22 μm滤膜过滤，制得母液0.1 g/mL。在BHI平板上加入200 μL对数期菌液涂板，置于无菌牛津杯，向牛津杯中加入样品200 μL，阴性对照加入200 μL灭菌水，盖上陶瓦盖，于28 ℃培养箱中静置过夜，第二天测量抑菌圈。
1.2.6 耐药基因检测
以病原菌基因组DNA为模板，采用文献[10]报道的特定引物检测blaB耐药基因，阴性对照为蒸馏水。blaB的通用引物为F:5’-TAAATATGCCGCTAATGC-3’；R:5’-CCCCAGGTCTTTTGAATC-3’，PCR扩增体系（25 μL）：2×Taq MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，加灭菌超纯水定容至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃，延伸 5 min。取5 μL扩增产物，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像系统观察 PCR 扩增结果，PCR扩增产物由成都擎科梓熙生物有限公司测序。
2 结果与分析
2.1 发病情况调查与临床病变观察
由图1可知，患病蛙表现为头部较正常蛙偏斜，后肢肌肉发红，眼球突出、浑浊；脑积液增多、解剖见肺部充血肿大。初步诊断，该患病蛙有疑似蛙脑膜炎的症状。
2.2 病理组织学观察
由图2可知，患病蛙眼球被红细胞浸润；脑皮质区红细胞增多、胶质细胞增多；肺组织有出血现象；脾窦扩张；肾小体毛细血管球坏死溶解、肾小囊壁层上皮细胞坏死，仅留下轮廓结构；骨骼肌显示有变性和坏死现象。
2.3 细菌分离与培养
通过观察可知，所有接种部位均有淡黄色菌落生长，且其菌落形态相似，菌落大小1～2 mm，边缘光滑，表面湿润，隆起。将平板上的菌落挑取少许均匀涂于载玻片上，自然干燥后革兰氏染色观察，为革兰氏阴性短杆菌（图3）。
2.4 细菌鉴定
由图4可知，利用16S rDNA和gyrB通用引物进行PCR扩增，扩增出约1 500 bp（16S rDNA基因）和1 200 bp（gyrB基因）的目的条带，经BlastN程序进行序列比对，本次分离得到的病原菌为蛙脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）。
2.5 药敏试验结果
表2 病原菌药敏试验结果 |
| 抗菌药物名称 | 药敏纸片含量/（μg/片） | 抑菌圈大小/mm | 敏感 程度 |
|---|---|---|---|
| 头孢西丁（美福仙） | 30 | 26 | S |
| 阿米卡星 | 30 | 18 | S |
| 卡那霉素 | 30 | 0 | R |
| 庆大霉素 | 10 | 0 | R |
| 链霉素 | 10 | 15 | S |
| 新霉素 | 30 | 0 | R |
| 四环素 | 30 | 0 | R |
| 多西霉素 | 30 | 18 | S |
| 阿奇霉素 | 15 | 28 | S |
| 麦迪霉素 | 30 | 22 | S |
| 氟苯尼考 | 30 | 31 | S |
| 多黏菌素B | 300 IU | 0 | R |
| 两性霉素B | 30 | 0 | R |
| 诺氟沙星 | 5 | 0 | R |
| 氧氟沙星 | 5 | 0 | R |
| 洛美沙星 | 10 | 0 | R |
磺胺异 唑 | 300 IU | 0 | R |
| 复方磺胺甲 唑 | 23.75/1.25 | 0 | R |
| 新生霉素 | 30 | 12 | I |
| 利福平 | 5 | 25 | S |
|
表3 病原菌抗菌肽试验结果 |
| 抗菌肽样本 | 抑菌圈直径/mm |
|---|---|
| T1 | 7 |
| T2 | 10 |
| T3 | 7 |
| T4 | 7 |
| T5 | 13 |
| 阴性对照 | 8 |
2.6 耐药基因检测结果
3 结论与讨论
本研究从黑斑蛙脑组织、脾脏中分离出病原菌，形态学和分子鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白菌，药敏试验显示该菌对多种抗菌药具有耐药性，耐药基因blaB检测为阳性，这可能是此次黑斑蛙感染后使用抗生素几乎无效的原因。抗菌肽作为替抗绿色产品，可减少抗生素的使用，本次抑菌试验筛选出有效抗菌肽T5（富利肽），但其对黑斑蛙的安全性和临床应用有待进一步研究。本研究发现，患病蛙肾组织、肺组织等组织内充满大量红细胞，两栖类动物的红细胞具有吞噬功能和免疫活性；脑胶质细胞明显增多，说明脑组织受到了细菌的侵染，细菌能通过血脑屏障引起黑斑蛙斜颈和在水中狂游打转的神经症状。目前，关于该菌是如何侵入大脑的相关研究较少，本研究表明，以蛙为模型研究该菌的致病机制具有一定的可行性。
综上，本研究对某养殖场的患病蛙进行解剖观察，患病蛙眼球、脑组织、肾脏等组织均有一定的损伤，从内脏组织中分离出病原菌，鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白菌；该菌对庆大霉素等11种抗生素表现为耐药，抗菌肽T5（富利肽）对该病原菌表现出较佳的抑菌性。研究为脑膜炎败血伊丽莎白菌的临床防控提供参考，也为利用蛙类感染模型深入研究该菌的致病机制奠定了基础。