蛋白质是高校生物化学课程的核心教学内容之一。其中，蛋白质的分离、浓度测定及分析鉴定等实验课程，是生物技术专业本科生深入理解和掌握蛋白质基础理论的重要实践内容[1]。酶是一类具有高效催化功能的蛋白质，其反应动力学研究是生物化学的核心内容[2-3]。由于酶在生物体内含量较低，直接检测困难，通常通过测定其活性来进行定量分析[4]。
米氏常数测定是生物化学实验的经典内容，Michaelis等[5]应用动力学方法推导得到酶催化过程的动力学方程，反应速度V=V m[S]/（K m+[S]）=V m/（1+Km/[S]），其中V m为酶促反应最大速度；K m为米氏常数；[S]为底物浓度。K m反映了酶和底物亲和力的大小，是酶促反应速度达到最大反应速度50%时的底物浓度[6-7]。磷酸酶是一种促使底物去磷酸化的酶，依据其反应条件可分为碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，EC 3.1.3.1，ALP）和酸性磷酸酶（Acid phosphatase，EC 3.1.3.2，AP）[8]。ALP广泛存在于原核生物和哺乳动物组织，是一种底物专一性较低的磷酸单酯水解酶[9-10]。AP普遍存在于土壤和植物体内[11]，参与植物体磷营养的调节和逆境适应[12]。
在生物化学实验课程的实践学习中，依据教学大纲中“蛋白质粗液的提取”“蛋白质浓度测定及SDS-PAGE电泳检测”以及“米氏常数测定”等相关内容，以市售绿豆芽为实验材料，经研磨法获得蛋白质粗提物，利用BCA法测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳检测，并在0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.6）条件下，以对硝基苯磷酸二钠（PNPP-Na2）为底物[8]测定酸性磷酸酶的米氏常数，全面系统地学习了蛋白质化学的基本理论知识，同时了解了蛋白酶学的研究和发展历程，掌握了离心分离、分光光度法测定物质浓度、SDS-PAGE电泳等基本实验技能。
1 实验设计
1.1 材料
以市售绿豆芽为实验对象。试剂：0.1 mmol/L pNp溶液，0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH 10.0），0.2 mol/L HAc-NaAc缓冲液（pH 5.6），5.0 mmol/L PNPP-Na2（pH 5.6），BCA protein assay kit（Beytime），蛋白标准品BSA（0.5 mg/mL），Tris-甘氨酸电泳缓冲液，30% Arc，4×SDS-PAGE分离胶缓冲液，4×SDS-PAGE浓缩胶缓冲液，10% APS，TEMED，20×TBS缓冲液，2×SDS上样缓冲液。仪器：试管，取液器，酶标仪，离心机，垂直电泳仪，研钵等。
1.2 实验方法
1.2.1 pNp标准曲线绘制
取7支试管，分别记为0、1、2、3、4、5、6，然后依次加入0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH 10.0）5.0、4.8、4.6、4.2、3.8、3.4、3.0 mL，再分别加入0.1 mmol/L pNp溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，摇匀，室温放置10 min。分别吸取0.2 mL混合液加于酶标板孔中，测定OD410值，实验设3次重复。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，利用Excel软件绘制标准曲线。
1.2.2 蛋白标准品BSA浓度标准曲线绘制
依照BCA protein assay kit（Beytime）说明书配置BCA工作液，分别取蛋白标准品BSA（0.5 mg/mL）0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入酶标板孔中，再用1×TBS缓冲液补足到20 μL，配制浓度分别为0、0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL 的标准品BSA。再向各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min，测定OD562值，实验设3次重复。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，利用Excel软件绘制标准曲线。
1.2.3 蛋白质粗液提取
取市售绿豆芽茎段约20 g，在研钵中彻底捣碎，室温静置0.5 h，采用双层纱布进行过滤，滤液4 000 r/min离心10 min，用移液器吸取上清液于Epp管中，即为蛋白质粗提液，4 ℃存放备用。
1.2.4 蛋白质粗提液浓度测定
取20 μL 蛋白质粗提液于酶标板孔中，加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20 min，测定OD562值，实验设3次重复。利用1.2.2标准曲线方程计算获得蛋白浓度。
1.2.5 SDS-PAGE电泳检测
分别配置10%分离胶和5%的浓缩胶制备SDS-PAGE电泳凝胶。取1 000 μL蛋白质粗酶液，冷冻干燥至粉末状，用15 μL 1×TBS缓冲液溶解，加入等体积2×SDS上样缓冲液后，沸水浴5 min，冷却至室温，12 000 r/min离心10 min，取20 μL上清液点样，经SDS-PAGE电泳分离、考马斯亮蓝染色后，利用凝胶成像系统进行拍照分析。
1.2.6 酸性磷酸酶米氏常数测定
取7支试管，分别记为0、1、2、3、4、5、6，各加入5.0 mmol/L PNPP-Na2（pH 5.6）溶液0、0.10、0.14、0.20、0.25、0.33、0.50 mL，再用0.20 mol/L HAc-NaAc（pH 5.6）缓冲液补足至0.50 mL，37 ℃预热2 min；依次向各试管中加入37 ℃预热的蛋白质粗提液0.50 mL，立即摇匀，37 ℃精确反应10 min后，立即加入0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH 10.0）终止反应。分别吸取200 μL上述反应液于酶标板孔中，测定OD410值，实验设3次重复。利用1.2.1标准曲线方程计算获得反应产物pNp的浓度，结合反应时间求出反应速度V，以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求出K m值和V m值。
2 结果与分析
2.1 标准曲线绘制
由图1可知，pNp标准曲线方程为y=11.062x+0.044 4，其中R2 =0.992 1。蛋白标准品BSA的标准曲线方程为y=0.585 7x+0.223 4，其中R2 =0.957 8。
2.2 蛋白质粗提液浓度测定
浓度测定进行3次重复，分别获得OD562值为2.646、2.794、2.916，其平均值为2.785。利用标准曲线方程y=0.585 7x+0.223 4，计算得到的蛋白质粗提液浓度为4.374 mg/mL。
2.3 SDS-PAGE电泳检测
2.4 酸性磷酸酶米氏常数测定
3 实践效果
蛋白质提取分离、鉴定及米氏常数测定是生物化学实验教学大纲中的必修内容[13]。蛋白质的定量和定性分析技术是蛋白质化学中的基本技术之一，BCA法和SDS-PAGE电泳是定量测定蛋白浓度的常用方法。学生通过课前预习基础理论；课中在教师指导下进行实验操作；课后通过撰写实验报告深化理解，成功利用BCA法测定了实验材料绿豆芽茎段总蛋白的含量，并在冷冻浓缩后通过SDS-PAGE电泳测定了总蛋白的分布特征。通过课程实践学习，深刻理解了蛋白质提取鉴定和酶学中米氏常数的基本概念，BCA测定蛋白浓度以及SDS-PAGE电泳的原理。其次，掌握了离心分离、SDS-PAGE电泳、酶标仪使用等基本实验技能。
综上，本文通过生物化学实验蛋白质提取分离分析及米氏常数测定的实践实验，成功利用BCA法测定了绿豆芽茎段总蛋白的含量，通过SDS-PAGE电泳分析了总蛋白的含量分布，同时测定了绿豆芽茎段总蛋白中酸性磷酸酶的米氏常数值。本次实验课程系统性地强化了蛋白质提取分离、定量分析及米氏常数测定等基础理论知识的实践认知。通过将抽象复杂的理论概念转化为具体的实验操作，加深了对专业知识的理解；通过仪器设备的实际操作深入掌握了其工作原理，激发了学生对科学研究的兴趣和热情。