磷是植物生长发育不可缺少的主要营养元素，对保持品种的优良特性有明显作用[1]。土壤有效磷是能够被作物直接吸收利用的主要磷素形态[2]。在生产实践中，为保证作物的高质高产，通常施用磷肥以提高土壤有效磷的含量。然而，过量的磷肥会导致土壤磷素积累，造成淋失风险[3-4]。有效磷含量是土壤养分状况的一个重要衡量指标，对作物的产量、土壤肥力水平以及农业活动中磷的环境风险评价等具有重要作用[5]，分析不同类型土壤有效磷含量变化，可为科学施用磷肥提供参考[6]。
目前，土壤有效磷检测标准可参考NY/T 1121.7—2014《土壤检测 第7部分：土壤有效磷的测定》和LY/T 1232—2015《森林土壤磷的测定》。对于pH≥6.5的土壤一般采用NY/T 1121.7—2014《土壤检测 第7部分：土壤有效磷的测定》中的碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法，但在实践中，发现常规操作中部分存在一些问题，如标准曲线采用25 mL容量瓶定容时，加显色剂摇动时剧烈冒泡可能导致液体溢出、驱赶气泡消耗时间可能使显色不在最佳环境中反应[7]。近年来，相关研究人员利用土壤光谱特性来分析土壤中有效磷的含量[8-9]，尽管利用电感耦合等离子体发射光谱检测土壤有效磷含量较为简便且能实现自动化，但磷元素的谱线强度较弱且存在较强的连续背景干扰和光谱干扰，导致分析结果的稳定性不高。本研究在标准方法的基础上进行了显色容器、超声波排气泡等方面的尝试，以测定土壤中的有效磷含量，为提高碱性土壤有效磷检测质量和效率提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试碱性土壤为GBW07460（ASA-9），GBW（E）070336（ASA-15），GBW（E）070338（ASA-17）。
BSA822-CW电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HZ-9310K-A往复振荡机，太仓市华利达实验设备有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计，岛津（苏州）有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；FE20酸度计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
氢氧化钠溶液（100 g/L）、碳酸氢钠浸提剂（0.50 mol/L，pH=8.5）、酒石酸锑钾溶液、钼锑贮备液、钼锑抗显色剂、磷标准贮备液（100 mg/L），磷标准溶液（5.00 mg/L）等试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯试剂。磷酸二氢钾为上海麦克林生化科技股份有限公司生产的高纯试剂。分析用水为GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中规定的二级水。
1.2 有效磷的浸提
称取通过2 mm筛孔的风干土壤试样2.50 g，置于200 mL塑料瓶中，加入碳酸氢钠浸提剂50.0 mL，在（25±1）℃，（180±20）r/min条件下振荡30 min，用无磷滤纸过滤。
1.3 不同方法的标准曲线的绘制
1.3.1 标准法
分别吸取不同分量的（0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL）5.00 mg/L标准磷溶液于25 mL容量瓶中，加入10.00 mL碳酸氢钠浸提剂，5.00 mL钼锑抗显色剂，缓慢振荡排出CO2后加水定容，配制成浓度依次为0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的标准磷溶液。置于20 ℃以上环境中稳定30 min，于880 nm波长条件下测定吸光度，以标准系列溶液的磷浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线，计算回归方程。
1.3.2 方法1
吸取不同分量的（0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL）5.00 mg/L标准磷溶液于50 mL的比色管内，加入10.00 mL碳酸氢钠浸提剂和5.00 mL钼锑抗显色剂，利用超声波振荡排出CO2，加水定容至比色管的25 mL刻度线。其余步骤同1.3.1。
1.3.3 方法2
分别吸取不同分量的（0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL）5.00 mg/L标准磷溶液于50 mL容量瓶中，加入20.00 mL碳酸氢钠浸提剂，10.00 mL钼锑抗显色剂，缓慢摇动，利用超声波振荡排出CO2后加水定容至50 mL刻度线，配制成浓度为0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的标准磷溶液。其余步骤同1.3.1。
1.4 土壤有效磷测定
使用3种方法测定ASA-9、ASA-15、ASA-17 3种土壤的有效磷含量。计算如式（1） 。
W（mg/kg）=（C－C 0）×V×D/m
式中，W为有效磷含量；C为标准曲线求得的显色液中磷的浓度（mg/L），V为显色液体积（mL）；D为分取倍数，D=浸提液体积/吸取液体积；m为风干土样质量。
1.4.1 标准法
吸取2.00～10.00 mL试样溶液于50 mL容量瓶或锥形瓶中，缓慢加入钼锑抗显色剂5.00 mL，并轻轻摇晃排出CO2气体；添加10.00 mL水并充分摇匀，直到CO2完全消除。置于20 ℃以上环境中稳定30 min，于880 nm波长下测定吸光度。
1.4.2 方法1
吸取2.00～10.00 mL试样溶液于50 mL比色管中，缓慢加入5.00 mL钼锑抗显色剂，利用超声波振荡排除CO2，加水定容至25 mL。其余步骤同1.4.1。
1.4.3 方法2
吸取2.00～10.00 mL试样溶液于50 mL容量瓶或锥形瓶中，缓慢加入钼锑抗显色剂5.00 mL，慢慢摇动，利用超声波振荡除尽CO2，再加入10.00 mL水，充分摇匀。其余步骤同1.4.1。
1.5 精密度计算
选取ASA-9和ASA-17，按优化的测试条件全程序平行测定6次，计算测定值的平均值、相对标准偏差（RSD）。
1.6 浸提温度对碱性土壤有效磷测定的影响
选取ASA-9和ASA-15，于夏季（7月）和冬季（1月）在24～26 ℃浸提温度下按照方法2分别测定有效磷含量。
1.7 数据处理
利用Excel软件对数据进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
由图1可知，本研究所用方法建立的方程R2 为0.999 9（≥0.999 0），说明标准曲线线性关系良好。标准方法采用25 mL容量瓶定容，加完标准溶液、浸提剂和显色剂后，溶液已接近容量瓶的瓶口，气泡难以除尽，且操作不当极易喷出造成损失，标准曲线较难1次成功（R2 <0.999 0），需要删减标准曲线浓度点或重新配置操作不当的浓度点，重新显色，费时费力。而本研究的方法采用50 mL比色管或容量瓶，加完显色剂后液面距离瓶口还有一大段距离，排出气泡时液面不易喷出，操作稳定且一次成功率高，采用超声波排出气泡速度快，能排尽气泡，显色体系更加稳定。
2.2 土壤有效磷含量
由表1可知，标准法测定的ASA-9、ASA-15、ASA-17土壤样品有效磷含量分别为23.4、52.7、8.0 mg/kg，方法1测定的分别为24.1、53.5和8.3 mg/kg；方法2测定的分别为23.8、53.9、8.6 mg/kg。不同方法测定的同一土壤样品的有效磷含量接近，且均在土壤规定的标准范围内，说明本研究方法可有效测定土壤有效磷含量，与标准法无明显区别。
表1 3种方法测定的土壤有效磷含量单位：（mg/kg） |
| 土壤样品 | 标准值 | 标准法 | 方法1 | 方法2 |
|---|---|---|---|---|
| ASA-9 | 24.0±3.0 | 23.4 | 24.1 | 23.8 |
| ASA-15 | 53.0±5.0 | 52.7 | 53.5 | 53.9 |
| ASA-17 | 8.1±0.9 | 8.0 | 8.3 | 8.6 |
2.3 精密度
由表2可知，方法1测定的ASA-9和ASA-17土壤样品有效磷的RSD分别为1.99%和3.39%，方法2分别为2.49%和3.22%，说明两种改进方法检测结果稳定，精密度高。
表2 精密度 |
| 样品 | 方法 | 重复的测定值（mg/kg） | 平均值/（mg/kg） | RSD/% | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ||||
| ASA-9 | 方法1 | 23 | 23.7 | 23.9 | 24.3 | 23.2 | 23.6 | 23.6 | 1.99 |
| 方法2 | 23.5 | 24.1 | 24.6 | 24.7 | 23.8 | 23.2 | 24.0 | 2.49 | |
| ASA-17 | 方法1 | 8 | 7.9 | 8.5 | 8.6 | 8.2 | 8.4 | 8.3 | 3.39 |
| 方法2 | 8.3 | 8.5 | 8 | 7.9 | 7.8 | 8.1 | 8.1 | 3.22 | |
2.4 浸提温度对碱性土壤有效磷测定结果的影响
由表3可知，相同的浸提温度下，冬季的有效磷测定结果略低于夏季。因此，在环境温度较低时，可以将浸提液控制在25～26 ℃再加入浸提瓶；环境温度较高时，将浸提液控制在24～25 ℃再加入浸提瓶。
表3 浸提温度对有效磷测定结果的影响单位：（mg/kg） |
| 浸提温度/℃ | ASA-9（7月） | ASA-9（1月） | ASA-15（7月） | ASA-15（1月） |
|---|---|---|---|---|
| 24 | 23.7 | 23 | 53.6 | 52.7 |
| 25 | 24.1 | 23.4 | 54.1 | 53.2 |
| 26 | 24.6 | 23.8 | 54.5 | 53.8 |
3 结论与讨论
在实际操作中，NY/T 1121.7—2014《土壤检测 第7部分：土壤有效磷的测定》所规定的有效磷检测方法存在结果稳定性不足和测试效率偏低的问题。采用碳酸氢钠浸提待测液后，在加入含硫酸的钼锑抗显色液时会产生大量气泡，使用25 mL容量瓶进行显色反应，其瓶口较小，CO2气体难以迅速排出，操作时需逐滴加入显色剂并不断摇晃，否则易导致试液溢出，造成检测误差较大。基于此，本研究对该碱性土壤有效磷的检测方法进行优化，使用50 mL比色管或容量瓶，试液不易溢出，操作较为方便；使用超声波排出气泡，节省了人力。结果表明，本研究使用的方法有效磷含量在0～1.0 mg/L范围内线性关系良好，测定的土壤有效磷含量准确度好，精密度高，适合大批量分析测定，研究为提高碱性土壤有效磷检测效率和质量提供参考。
土壤有效磷测定的影响因素较多，在实际操作中要注意以下几个关键点。（1）土壤有效磷的测定值随浸提剂pH的增大而增大[10]，因此，每次浸提前要重新校正浸提剂pH，且保证同一批次的标准曲线、待测样品所使用的浸提剂一致。（2）在常规检测中，使用活性炭进行吸附可消除土壤本身的颜色干扰，但该操作过程复杂且易造成后续的污染问题。张飞龙[11]研究表明，在880 nm波长下测定土壤有效磷时可免去添加活性炭的步骤，此波长对浸出的有机质基本无吸收。（3）浸提时需用空气浴恒温振荡器，水浴恒温振荡器批量操作时瓶子放入的深度、水浴液面保持等因素较难控制，提取温度不稳定。因此，恒温振荡器应使用校准给出的修正值。（4）碱性土壤有效磷测定的结果准确性受温度的影响较大。因此，在实验过程中对浸提温度的控制尤为重要，其中浸提温度包括房间温度、液体温度和器具温度等。白厚义等[12]研究指出，以（25±1）℃为基准，温度每提高1 ℃土壤中的有效磷含量会增加0.43 mg/kg，这种影响会随着磷含量的不同而有所区别。实际测定时，需将室温调节至25 ℃左右，并保持使用器皿的温度与室温一致。在土壤有效磷浸提加入碳酸氢钠浸提剂前，先将恒温振荡器温度调整为（25±1）℃，将浸提剂提前放入恒温振荡器中保温。加入浸提剂前使用检定过的温度计测量液温，确保浸提剂温度控制在（25±1）℃。