猴樟（Camphora bodinieri）为樟科樟属常绿树种，是重要的园林绿化和油料加工树种之一，也是制造食品添加剂、香料、化妆品、抗菌试剂等的重要材料。该树种喜中性至微酸性土壤，对盐碱胁迫较敏感。农业生产中，部分灌溉农田存在不同程度的盐碱化，碱胁迫主要是由Na2CO3和NaHCO3引起的，土壤盐碱化会影响植物生长发育、作物产量及品质[1]。植物历经长期进化过程，具有较复杂的碱胁迫应答系统，包括调节根细胞内外酸碱平衡、积累渗透保护物质、调节离子吸收分配和转移、维持细胞内膜脂状态等[2]。
植物激素是植物内源性生物分子，在调节植物正常生长和维持植物细胞抗非生物胁迫的稳态方面起着重要的作用。植物激素通过增加光合作用、总叶绿素含量以及减少活性氧的产生，保护植物免受氧化应激，促进植物的生长发育。茉莉酸类物质（Jasmonates，JAs）是茉莉酸及其衍生物的统称，其包括顺式茉莉酮、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）、茉莉酸氨基酸等，主要来源于与氧脂素家族有关的环戊酮类化合物[3]。JAs在植物抵御干旱、盐碱、高温、低温等诱导的非生物胁迫中具有重要作用。刘畅等[4]研究表明，施加不同浓度外源褪黑素能缓解碱胁迫对谷子生长的抑制作用，褪黑素通过增加抗氧化酶活性，清除细胞内过量活性氧，从而提高谷子耐碱性。Ellouzi等[5]研究表明，盐胁迫下的拟南芥根中伸长区MeJA信号途径会被激活，细胞的伸长被抑制。李小玲等[6]研究发现，外源MeJA处理能提高黄芩种子在盐胁迫下的萌芽率，过氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）等抗氧化酶活性以及光合色素含量。杨梅等[7]研究表明，外源MeJA处理能提高盐胁迫下紫花苜蓿的抗氧化酶活性和渗透调节物质含量。Ahmad等[8]研究发现，在Na2CO3胁迫的玉米幼苗中引入JA可降低根和叶片的Na+/K+比值，减少Na+的积累。
在干旱、盐碱、高温、低温和重金属等逆境条件下，MeJA与脱落酸（Abscisic acid，ABA）、生长素（Indole acetic acid，IAA）、乙烯（Ethylene，ET）、赤霉素（Gibberellin，GA）、油菜素内酯（Brassinolide，BR）和水杨酸（Salicylic acid，SA）等激素介导的信号调控通路存在互作[3]。MeJA是植物适应盐碱胁迫的缓解剂，内源MeJA含量的增加、外源喷施MeJA均可增强植物的耐碱性。本研究以猴樟幼苗为试验材料，分析外源MeJA处理对猴樟幼苗耐碱性的影响，为猴樟耐盐碱胁迫分子机理研究和抗盐碱猴樟品种培育提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料为宿迁学院樟属植物种苗基地耐碱猴樟品系（20180903），于2023年9月从同一母树上采种，低温层积处理40 d后，于2024年2月播种于育苗池，5月移栽至盆中。栽培盆高22 cm，栽培基质为基地田园土∶草炭土3∶1，土壤pH 7.22，在玻璃温室中进行培养，正常水肥管理。
1.2 试验设计
试验材料共60盆，每盆1株，分为4个处理，每个处理15盆。于2025年3月12日9:00对每盆植株浇灌200 mmol/L Na2CO3溶液800 mL；当日下午3:00，对幼苗叶片外源喷施0（对照）、200、500、1 000 µmol/L MeJA溶液，用量为每盆100 mL，至叶面滴水为止，剩余溶液浇施于盆内，24 h后再喷施1次。正常培养7 d后，检测各处理幼苗叶片的光合色素含量、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、相对电导率、可溶性糖含量、类黄酮代谢关键酶基因表达量以及CAT、SOD和POD活性，3次生物学重复，取平均值进行统计。
1.3 试验方法
采用乙醇法[9]测定光合色素含量；采用硫代巴比妥酸法[9]测定MDA含量；采用浸泡法[9]测定相对电导率；采用蒽酮比色法[9]测定可溶性糖含量；采用紫外分光光度计法[9]测定CAT活性，采用氮蓝四唑法[9]测定SOD活性；采用愈创木酚法[9]测定POD活性。参考韩浩章等[10]的研究方法测定类黄酮代谢关键酶基因表达量，根据前期猴樟转录组数据，明确类黄酮代谢关键酶查尔酮合成酶基因（CbCHS）、苯丙氨酸解氨酶基因（CbPAL）、二氢黄酮醇还原酶基因（CbDFR）、类黄酮糖基转移酶基因（CbUFGT）的CDS序列，利用Primer 5.0软件设计荧光定量引物，由北京擎科生物科技有限公司合成引物（表1）。以耐碱猴樟品系（20180903）叶片为材料，以CbActin1作为内参基因进行实时荧光定量PCR，采用荧光定量PCR仪（Q2000B，杭州朗基科学仪器有限公司）进行CbCHS、CbPAL、CbDFR、CbUFGT基因相对表达量测定。采用隶属函数法[11]对外源MeJA处理下猴樟幼苗的耐碱性进行综合评价。综合评价值表示植物耐碱性强弱，综合评价值大小范围在0~1，综合评价值越接近1表示植物耐碱性力越强，反之耐碱性越弱[12]。
表1 实时荧光定量PCR所用引物 |
| 基因名称 | 上游引物（5'-3'） | 下游引物（5'-3'） |
|---|---|---|
| CbCHS | GTGGCTCATCCAGGTTTGC | CCCTTCACCCGTTGTCTTA |
| CbPAL | GGCAGCCGTCGCCTATGA | TCCTTGCTTGGTTCTCCTGTG |
| CbDFR | CTTGAGGTTGCCTACGG | TAATCGCCCACTAAATCG |
| CbUFGT | CGGCAATAGCATAGAACG | GCTCCCGAAGGAAACAT |
| CbActin1 | TAGTATGCCAGCGAACGAGT | TGCCATCTAGCTCCCTCTTG |
1.4 数据分析
采用Microsoft Excel软件制作表格，采用SPSS 21.0软件进行数据统计，利用最小显著差数法（LSD）分析数据的差异性。
2 结果与分析
2.1 对光合色素含量的影响
由表2可知，外源MeJA处理会影响碱胁迫下猴樟幼苗光合色素的含量，其中200 µmol/L外源MeJA处理的幼苗叶片光合色素含量较高，叶绿素a、b和类胡萝卜素含量较对照分别增加7.13%、57.31%、21.93%。随着MeJA处理浓度的增加，叶绿素a、b含量呈先上升后下降的趋势，类胡萝卜素含量呈先上升后下降再上升的趋势。1 000 µmol/L外源MeJA处理的叶绿素a、b含量较对照分别减少38.89%和37.81%，差异具有统计学意义（P＜0.05）；类胡萝卜素含量较对照减少20.94%，差异无统计学意义（P>0.05）。综合来看，200 µmol/L外源MeJA处理有利于提高碱胁迫下猴樟幼苗叶片光合色素含量。
表2 外源MeJA处理对碱胁迫下猴樟幼苗叶片光合色素含量的影响 |
| 指标 | MeJA浓度/（µmol/L） | |||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 200 | 500 | 1 000 | |
| 叶绿素a/（µg/g） | 881.36±24.85 a | 944.20±36.48 a | 645.17±42.63 b | 538.57±31.28 c |
| 叶绿素b/（µg/g） | 152.48±18.02 b | 239.86±26.32 a | 126.40±16.39 c | 94.82±18.55 c |
| 类胡萝卜素/（µg/g） | 28.36±4.12 ab | 34.58±5.02 a | 18.62±4.55 c | 22.42±5.71 bc |
|
2.2 对细胞膜脂质过氧化程度的影响
由表3可知，外源MeJA处理会影响碱胁迫下猴樟幼苗MDA含量、相对电导率和可溶性糖含量。其中，200 µmol/L处理的幼苗叶片MDA含量较对照减少34.41%，相对电导率较对照降低12.66个百分点，可溶性糖含量较对照增加44.78%，差异具有统计学意义（P＜0.05），500 µmol/L处理的MDA含量、相对电导率与对照差异无统计学意义（P>0.05），可溶性糖含量较对照增加78.63%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。1 000 µmol/L外源MeJA处理的MDA含量、相对电导率较对照分别增加76.89%、22.73%，可溶性糖含量较对照减少20.03%。综合来看，200、500 µmol/L外源MeJA处理有利于缓解猴樟幼苗叶片细胞膜脂过氧化程度。
表3 外源MeJA处理对碱胁迫下猴樟幼苗叶片细胞膜脂过氧化的影响 |
| 指标 | MeJA浓度/（µmol/L） | |||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 200 | 500 | 1 000 | |
| MDA/（nmol/g） | 15.75±1.13 b | 10.33±1.05 c | 13.14±2.84 bc | 27.86±4.66 a |
| 相对电导率/% | 36.52±5.04 a | 23.86±3.96 c | 47.40±5.76 a | 44.82±7.51 a |
| 可溶性糖/（mg/g） | 54.56±4.71 c | 78.99±5.26 b | 97.46±7.88 a | 43.63±6.36 c |
2.3 对抗氧化酶活性的影响
由表4可知，外源MeJA处理会影响碱胁迫下猴樟幼苗的抗氧化酶活性。其中，200 µmol/L外源MeJA处理的叶片CAT活性、POD活性较高，分别为140.86、692.85 U/g·FW，较对照分别增加17.71%、65.50%，差异具有统计学意义（P＜0.05）；500 µmol/L外源MeJA处理的叶片SOD活性较高，为382.83 U/g·FW，较对照增加59.83%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。综合来看，200、500 µmol/L外源MeJA处理有利于增强盐碱胁迫下猴樟幼苗叶片的抗氧化酶活性。
表4 外源MeJA处理对碱胁迫下猴樟幼苗叶片抗氧化酶活性的影响 |
| 指标 | MeJA浓度/（µmol/L） | |||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 200 | 500 | 1 000 | |
| CAT/（U/g·FW） | 119.67±7.22 b | 140.86±9.62 a | 135.68±10.25 a | 107.61±8.53 b |
| SOD/（U/g·FW） | 239.52±9.66 c | 324.41±4.56 b | 382.83±11.65 a | 256.67±7.52 c |
| POD/（U/g·FW） | 418.65±7.22 c | 692.85±10.53 a | 525.00±13.52 b | 325.35±7.95 d |
2.4 对类黄酮代谢关键酶基因相对表达量的影响
由表5可知，200 µmol/L外源MeJA处理的猴樟幼苗叶片类黄酮代谢关键酶基因相对表达量较高，CbCHS、CbDFR、CbUFGT基因相对表达量较对照分别增加248.88%、158.71%和151.07%，差异具有统计学意义（P＜0.05）；500 µmol/L处理的CbPAL基因相对表达量较对照增加144.30%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。综合来看，200、500 µmol/L外源MeJA处理提高猴樟幼苗叶片类黄酮代谢关键酶基因表达量的效果较好。
表5 外源MeJA处理对碱胁迫下猴樟幼苗叶片类黄酮代谢关键酶基因相对表达量的影响 |
| 基因名称 | MeJA浓度/（µmol/L） | |||
|---|---|---|---|---|
| 0 | 200 | 500 | 1 000 | |
| CbPAL | 2.28±0.77 b | 4.74±0.52 a | 5.57±0.33 a | 2.78±1.21 b |
| CbCHS | 2.23±0.22 c | 7.78±0.39 a | 4.02±0.45 b | 3.12±0.51 b |
| CbDFR | 3.56±0.66 c | 9.21±1.38 a | 7.50±0.76 b | 7.37±1.02 b |
| CbUFGT | 5.62±0.68 c | 14.11±1.51 a | 8.19±1.18 b | 8.41±1.21 b |
2.5 对猴樟幼苗耐碱性的综合评价
3 结论与讨论
盐碱胁迫会影响植物的养分吸收与转运、光合作用、呼吸代谢和能量平衡，降低作物的产量和品质。SOD、POD和CAT是组成植物细胞内抗氧化系统的主要成员，能够适时清除细胞内活性氧，维持细胞功能稳定。外源激素处理能减缓盐碱胁迫对植物的伤害，本试验中200 µmol/L 外源MeJA处理明显提高了碱胁迫下猴樟幼苗的光合色素含量、可溶性糖含量以及耐碱性，降低了MDA含量和相对电导率，增强了抗氧化酶的活性。陈运梁等[11]研究发现，盐胁迫下外源MeJA可诱导小桐子幼苗中的脯氨酸、甜菜碱、可溶性糖与无机离子大量积累。Zhang等[12]研究表明，外源MeJA处理能提高盐碱胁迫下菜用甘薯的茎秆质量、叶片质量、茎尖质量、叶绿素总含量，增强SOD、POD、CAT活性，明显降低叶片的相对电导率与MDA含量。山雨思等[13]研究显示，盐胁迫下外源MeJA处理明显提高了颠茄幼苗的脯氨酸、可溶性糖含量和耐盐性，缓解了光合色素的降解。以上研究结果与本研究结果一致。
植物的生长发育通常依赖代谢途径，包括氧化还原过程。类黄酮是一类分子量较低的多酚类次生代谢物，包括黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇和花青素六类，因其酚羟基上的氢原子可与过氧化自由基结合生成黄酮自由基，从而终止自由基链式反应，减少活性氧积累引起的氧化损伤[14]。类黄酮合成途径对环境条件变化较敏感，盐胁迫下秋茄[15]、草莓[16]通过上调PAL、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、类黄酮-3-羟化酶（F3H）等类黄酮代谢途径相关基因的表达，促进酚类、类黄酮物质的积累，提高植物耐盐碱能力。本研究表明，外源MeJA处理能提高碱胁迫条件下猴樟幼苗叶片类黄酮代谢关键酶基因表达量，推测MeJA通过激活类黄酮代谢途径提高植物耐碱性。关于MeJA诱导猴樟类黄酮代谢响应碱胁迫的分子机制尚需进一步研究。
综上，盐碱胁迫会降低植物光合能力，积累活性氧，促进细胞老化，使细胞内渗透调节物质流失、电导率增加，影响植物正常的生长发育。MeJA处理能提高碱胁迫下猴樟幼苗的光合色素含量、可溶性糖含量，降低MDA含量和相对电导率，增强抗氧化酶的活性，激活类黄酮代谢途径，提高植物耐碱性，以200 µmol/L MeJA处理的提高效果较好。