杉木（Cunninghamia lanceolata）作为南方地区重要的速生用材树种之一，其木材纹理通直、材质轻软且富有弹性，广泛应用于建筑、家具制造等多个领域，在林业经济中占据着重要地位[1-3]。随着杉木需求量的不断增加，种子繁殖和扦插繁殖等常见的繁殖方式易受季节、环境以及遗传稳定性等因素的限制，难以满足大规模、高效的种苗生产需求。
组织培养技术具有高效性和遗传一致性，是杉木良种繁育的关键手段之一，而丛生芽增殖作为组织培养的核心环节，其效率一定程度上影响了工厂化育苗的可行性[2，4]。近年来，相关学者针对不同杉木无性系展开深入研究，探索激素配比、外植体选择及培养条件优化策略。秦丽凤[5]研究发现，6-BA质量浓度是影响杉木外植体诱导率和新芽萌发数量的主要因素。曾碧欣等[6]通过调整6-苄氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）与3-吲哚丁酸（3-Indole butyric acid，IBA）的配比，明显提升了杉木T-c07组培苗的萌芽率。高嘉翔[7]研究表明，选择杉木茎段外植体进行合理消毒有利于杉木丛生芽的增殖。唐银等[8]研究发现，以红光∶蓝光为3∶1组合处理的杉木组培苗生根率较高，其组培苗生物量和株高均高于白光对照和蓝光处理。陈美香等[9]研究发现，光质对杉木组培苗不定芽增殖系数有明显影响。
目前，在杉木丛生芽增殖方面取得了一定进展，但由于无性系的差异、影响因素的复杂性等，增殖效率相对较低，难以满足工厂化育苗的需求。此外，核黄素等辅助因子的作用机制尚未明晰，在一定程度上限制了培养基配方的进一步优化。基于此，本研究以‘洋-061'杉木无性系为材料，采用正交试验设计，系统解析6-BA、萘乙酸（1-Naphthaleneacetic acid，NAA）及核黄素浓度对杉木丛生芽增殖的影响，以筛选高效稳定的培养基配方，为杉木规模化育苗提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
杉木优良无性系‘洋-061'穗条采自福建省洋口国有林场采穗圃。该无性系母树来源于洋口林场杉木第2代单亲子代测定林中的优良家系，并经筛选确定为表现优良的个体。在采样时，选取生长健壮且无病虫害的当年生杉木穗条作为外植体材料，并对其进行低温保湿处理以确保材料活性。后续研究工作均在福建农林大学田间实验室进行。
本试验所使用的试剂主要包括植物生长调节剂6-BA、NAA、核黄素；MS培养基、蔗糖、琼脂；消毒试剂75%乙醇、0.1% 升汞溶液。仪器主要包括超净工作台，用于外植体的无菌操作；高压蒸汽灭菌锅，用于培养基和器械的灭菌；光照培养箱，提供适宜的培养环境；电子天平，用于试剂和培养基成分的称量；pH计，精确测量培养基的pH。试验过程中使用的各种玻璃器皿、移液器、手术刀、镊子等器具均经过严格清洗和灭菌处理，以保证试验环境的无菌状态。
1.2 试验设计
丛生芽增殖采用L9（33）正交表进行试验设计，选择6-BA、NAA、核黄素作为试验因素，每个因素设置3个水平（表1）。
表1 3因素3水平试验设计 |
| 因素 | 水平1 | 水平2 | 水平3 |
|---|---|---|---|
| 6-BA/（mg/L） | 0.5 | 1.0 | 1.5 |
| NAA/（mg/L） | 0.10 | 0.15 | 0.20 |
| 核黄素/（g/L） | 0 | 0.1 | 0.2 |
按照试验设计，将各因素及其水平进行排列组合，得到9个试验处理，每个处理重复3次（表2）。每个重复接种13瓶，每瓶接种3个不定芽，以确保试验结果的可靠性和准确性。
表2 杉木丛生芽增殖试验正交设计 |
| 处理 | 6-BA/（mg/L） | NAA/（mg/L） | 核黄素/（g/L） |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.5 | 0.10 | 0 |
| 2 | 0.5 | 0.15 | 0.1 |
| 3 | 0.5 | 0.20 | 0.2 |
| 4 | 1.0 | 0.10 | 0.2 |
| 5 | 1.0 | 0.15 | 0 |
| 6 | 1.0 | 0.20 | 0.1 |
| 7 | 1.5 | 0.10 | 0.1 |
| 8 | 1.5 | 0.15 | 0.2 |
| 9 | 1.5 | 0.20 | 0 |
1.3 试验方法
1.3.1 外植体的处理与接种
将采集的杉木外植体用清水冲洗干净，去除表面的泥土和杂质。在超净工作台中，先用75%乙醇浸泡30 s进行消毒，然后用0.1%升汞溶液浸泡8 min进行灭菌。其间不断轻轻摇晃，使消毒剂充分接触外植体表面，以确保消毒彻底。消毒后，用无菌水冲洗外植体5次，每次冲洗2 min，以彻底清除残留的消毒剂。将消毒后的外植体切成1～2 cm长的茎段，每个茎段保留1～2个腋芽，接种到预先准备好的培养基上，进行丛生芽初代诱导培养。
1.3.2 培养基的配制与接种
以MS培养基为基础培养基，根据正交试验设计方案，精确添加不同浓度的6-BA、NAA和核黄素。同时，添加40 g蔗糖作为碳源，并加入6 g琼脂使培养基凝固。利用pH计将培养基的pH调节至5.8，以营造适宜杉木外植体生长的环境。完成培养基配制后，将其分装到培养瓶中进行高压灭菌处理，在121 ℃、1.05 kg/cm²的条件下灭菌20 min，以彻底杀灭培养基中的杂菌。将获得的丛生芽作为增殖培养试验材料，每个处理接种13瓶，每瓶接种3个不定芽。接种时，使用无菌镊子和手术刀，动作迅速、准确，避免不定芽长时间暴露在空气中，以减少污染的风险。接种完成后，将培养瓶置于培养室中进行培养，培养室温度设置在（25±2）℃，光照强度设置在2 000～3 000 lx，光周期16 L∶8 D。
1.4 指标测定与数据处理
1.4.1 丛生芽的增殖系数计算
在培养过程中，定期观察丛生芽的增殖情况，记录丛生芽增殖的有效芽数，及时发现并处理可能出现的污染、褐化等问题。利用Excel软件对试验数据进行初步整理和记录，建立详细的数据表格，确保数据的准确性和完整性。增殖系数计算如式（1） 。
增殖系数=诱导出有效不定芽总数/外植体总数
1.4.2 极差分析
极差分析能够直观地判断各因素对杉木丛生芽增殖的影响程度。极差（R）是指各因素在同一水平下试验指标平均值的最大值与最小值之差，R值越大，说明该因素对试验指标的影响越大。
1.4.3 方差分析
利用SPSS 26.0软件进行方差分析（ANOVA），检验6-BA、NAA、核黄素及其交互作用对杉木丛生芽增殖系数指标的影响程度。方差分析能够将试验数据的总变异分解为各因素和误差引起的变异，通过比较不同因素与误差的均方比值（F值），判断各因素对试验指标的影响程度。当F值大于临界值时，说明该因素对试验指标有明显影响。为进一步确定各因素不同水平之间的差异，采用邓肯氏新复极差法进行多重比较，根据P值来判断差异性。该方法能够在方差分析的基础上，判断出各因素不同水平之间的差异性。
2 结果与分析
2.1 杉木丛生芽增殖系数
由表3可知，经过40 d的培养，各处理组的杉木外植体在不同培养基上呈现出的丛生芽增殖效果存在差异。从增殖系数来看，处理3的丛生芽增殖系数较高，达3.84，说明该处理下每个外植体产生的丛生芽数量较多，且生长较为健壮。处理5和处理9的增殖系数较低，分别为2.25和1.67。表明不同的激素和营养物质组合对丛生芽的增殖和生长状态产生了明显影响。
表3 不同处理下的杉木丛生芽增殖系数 |
| 处理 | 6–BA/（mg/L） | NAA/（mg/L） | 核黄素/（g/L） | 增殖系数 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.5 | 0.10 | 0 | 3.52±0.34 |
| 2 | 0.5 | 0.15 | 0.1 | 3.68±0.28 |
| 3 | 0.5 | 0.20 | 0.2 | 3.84±0.31 |
| 4 | 1.0 | 0.10 | 0.2 | 3.12±0.25 |
| 5 | 1.0 | 0.15 | 0 | 2.25±0.18 |
| 6 | 1.0 | 0.20 | 0.1 | 2.33±0.21 |
| 7 | 1.5 | 0.10 | 0.1 | 2.42±0.23 |
| 8 | 1.5 | 0.15 | 0.2 | 2.78±0.26 |
| 9 | 1.5 | 0.20 | 0 | 1.67±0.15 |
2.2 丛生芽增殖系数极差分析
K1、K2、K3分别表示各因素在1水平、2水平、3水平下增殖系数的总和均值。由表4可知，各因素对杉木丛生芽增殖的影响由强到弱依次为6-BA>核黄素>NAA。6-BA在1水平（0.5 mg/L）下，对应的增殖系数总和均值K1为3.68；在2水平（1.0 mg/L）下，K2为2.57；在3水平（1.5 mg/L）下，K3为2.29。通过公式R=max（K1，K2，K3）－min（K1，K2，K3）计算得出，3个因素中6-BA的R最大，为1.39，表明6-BA浓度变化是影响杉木丛生芽增殖系数的主要因素。NAA的R为0.41，相对较小，说明NAA浓度变化对丛生芽增殖系数的影响较小。综合来看，6-BA的浓度变化对杉木丛生芽增殖的调控作用明显。
表4 杉木丛生芽增殖系数极差分析 |
| 因素 | K1 | K2 | K3 | R |
|---|---|---|---|---|
| 6-BA | 3.68 | 2.57 | 2.29 | 1.39 |
| NAA | 3.02 | 2.90 | 2.61 | 0.41 |
| 核黄素 | 2.48 | 2.81 | 3.25 | 0.77 |
2.3 杉木丛生芽增殖系数方差分析
由表5可知，6-BA的P值为0.002，表明6-BA浓度变化对杉木丛生芽增殖的影响具有统计学意义（P＜0.05）。NAA和核黄素的P值分别为0.473和0.105，说明在本试验条件下，NAA和核黄素对杉木丛生芽增殖的影响无统计学意义（P>0.05）。在交互作用方面，6-BA×NAA、6-BA×核黄素、NAA×核黄素的P值均大于0.05，表明6-BA、NAA和核黄素之间的相互作用对丛生芽增殖的影响较小。综合来看，6-BA是影响杉木丛生芽增殖的关键因素。
表5 杉木丛生芽增殖系数方差分析 |
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|
| 6-BA | 4.56 | 2 | 2.28 | 11.40 | 0.002** |
| NAA | 0.32 | 2 | 0.16 | 0.80 | 0.473 |
| 核黄素 | 1.12 | 2 | 0.56 | 2.80 | 0.105 |
| 6-BA×NAA | 0.24 | 4 | 0.06 | 0.30 | 0.876 |
| 6-BA×核黄素 | 0.48 | 4 | 0.12 | 0.60 | 0.663 |
| NAA×核黄素 | 0.16 | 4 | 0.04 | 0.20 | 0.937 |
| 误差 | 0.40 | 2 | 0.20 |
|
3 结论与讨论
在植物细胞内，6-BA能够与细胞表面的受体结合，激活一系列信号传导途径，促进细胞周期相关基因的表达。当6-BA浓度为0.5 mg/L时，细胞分裂较为活跃，外植体的芽分化数量较多，且芽体生长较为健壮，可能是该浓度下6-BA能够有效激活细胞分裂相关的生理过程，为芽的分化和生长提供充足的细胞数量。当6-BA浓度达1.5 mg/L时，芽的增殖系数有所降低，芽的生长受到抑制，表现为芽体矮小、瘦弱，可能是因为过高浓度的6-BA导致细胞分裂过于旺盛，细胞间竞争加剧，营养物质供应不足，从而影响了芽的正常生长和发育。本研究结果表明，6-BA是影响杉木丛生芽增殖的主导因子，其通过激活细胞分裂素信号通路促进侧芽分化，0.5 mg/L浓度下增殖系数可达3.84，这与莫雅芳等[10]的研究结果一致，但其最佳6-BA浓度（0.6 mg/L）略高于本研究结果，可能与外植体基因型及培养基基础成分的交互作用差异有关。
NAA通过与生长素受体结合，激活生长素信号传导途径，促进细胞伸长和细胞壁的松弛。在本试验中，NAA对杉木丛生芽增殖的影响相对较小，可能是因为在丛生芽增殖阶段，生长素未发挥主导调控作用。当NAA浓度为0.1 mg/L时，杉木外植体的生根情况较好，但丛生芽的增殖系数较低，表明该浓度下NAA倾向于促进生根，对丛生芽的增殖促进作用不明显。随着NAA浓度的增加，丛生芽的增殖和生长表现较为平衡，可能是因为NAA与6-BA的配比关系得到优化，二者的协同调控效应明显增强，最终实现丛生芽增殖与生长的平衡。
在杉木丛生芽增殖过程中，核黄素可能通过参与细胞的能量代谢、氧化还原反应等过程，影响细胞的活性和生长状态，从而对丛生芽的增殖和生长产生影响。在本试验中，核黄素对杉木丛生芽增殖的影响程度介于6-BA和NAA之间。当核黄素浓度为0.1 g/L时，丛生芽的生长有所改善，芽体更加健壮，可能是因为该浓度下核黄素能够增强细胞的活性和抗逆性，促进丛生芽的生长。当核黄素浓度过高时，可能会对细胞产生一定的毒害作用，抑制丛生芽的增殖和生长。这为杉木组织培养中营养物质的添加提供了新的研究方向，未来需进一步深入研究核黄素在杉木组织培养中的作用机制和最佳添加浓度。在实际应用中，需综合考虑以上因素，优化培养基配方，提高杉木丛生芽的增殖系数。
本研究通过正交设计试验，系统探究了6-BA、NAA和核黄素对杉木丛生芽增殖的影响，得出以下主要结论。在杉木丛生芽增殖过程中，6-BA、NAA和核黄素的组合明显影响了杉木丛生芽增殖系数。其中，6-BA是影响杉木丛生芽增殖的关键因素，其浓度变化对增殖系数的影响较大，0.5 mg/L 6-BA有效促进了杉木丛生芽的细胞分裂和芽的分化。在本试验条件下，NAA和核黄素对杉木丛生芽增殖的影响较小，但其浓度变化对丛生芽的生长状态产生一定作用。极差分析和方差分析表明，各因素影响杉木丛生芽增殖的主次顺序依次为6-BA>核黄素>NAA，且6-BA、NAA、核黄素之间的交互作用对杉木丛生芽增殖的影响较小。在大规模种苗生产方面，可依据本研究结果，建立高效的杉木丛生芽增殖生产线。后续研究可考虑将室内试验结果与田间试验相结合，进一步验证和优化培养基配方和培养条件，提高研究成果的实际应用价值。