油菜作为重要的经济作物之一，年种植规模较大，其高产稳产对保障食用油安全、实现油料作物绿色发展具有重要意义。近年来，干旱、渍害、冻害等自然灾害时有发生，对油菜生产影响较大，因此，油菜抗逆性研究是当前研究重点。干旱对甘蓝型油菜产量和品质的影响较大[1]。黄纯倩等[2]研究发现，甘蓝型油菜在不同生长发育阶段对干旱胁迫的敏感程度不同，当土壤相对含水量处于10%~15%时显著抑制种子萌发及成苗；苗期干旱胁迫会引起叶片黄化与脱落，严重时植株萎蔫死亡。胡盛等[3]研究指出，抽薹期水分亏缺会导致油菜叶片气孔关闭，光合效率降低，油菜籽产量及品质降低。相关农艺措施以及现代化转基因技术，受成本和技术限制，均难以大幅度提高油菜耐旱性。
氧化石墨烯（GO）是一种新型纳米材料，具有高比表面积、可调控的表面官能团及优异的生物相容性，且与石墨烯相比具有良好的溶解性，在日常生活中被广泛应用[4-5]。研究表明，纳米材料处理会使植物产生过量的活性氧（ROS），并影响蛋白质、脂质、糖和DNA的代谢，纳米材料抑制生长相关基因的表达，但上调脱落酸（ABA）和激素相关基因表达，同时GO和ABA处理显著影响幼苗的形态特征和内源激素含量[5-9]。虽然有关GO调控植物种子萌发、生长发育的研究不断深入，但关于GO在调控植物抗逆能力及其机制方面的研究相对较少。
本研究以甘蓝型油菜华油杂50为材料，幼苗干旱胁迫后，分别喷施15和25 mg/L GO，测量干旱胁迫下GO处理的幼苗超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性，脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）、赤霉素（GA）、吲哚-3-乙酸（IAA）、ABA含量的变化，以及RGA、GA3、ARF2和NCED等基因转录水平。研究GO对甘蓝性油菜耐旱性的影响，初步阐明其作用机制。
1 材料与方法
1.1 供试材料
该研究采用的甘蓝型油菜品种华油杂50，由长江大学油菜遗传改良课题组选育提供。试验过程中所涉及的关键化学制剂为分析级氧化石墨烯水相分散体系，由苏州碳丰科技所提供。
1.2 试验方法
种子经3%过氧化氢（H2O2）表面灭菌处理，25 ℃恒温条件下48 h暗处理催芽，幼苗移至人工气候培养箱中，培养条件设置为温度25 ℃、光照16 h（光照强度7 200 lx）/黑暗8 h。灭菌混合土（营养土∶大田土为1∶1）含水量80%，每3 d浇水300 mL/盆，生长30 d后，参照章子爽[10]的方法对幼苗进行干旱胁迫处理，待植株叶片萎蔫变黄时，喷施清水（CK）、15和25 mg/L GO，继续干旱处理3 d后复水。
1.3 指标测定及方法
1.3.1 油菜表型观察
于复水后持续监测植株生长表型变化，统计存活率以评估其抗旱性。其间采集叶片样本用于后续生理生化指标的测定分析。
1.3.2 生理指标测定
1.3.3 分子生物学鉴定
经序列比对，NCBI数据库获取目的基因mRNA保守区域序列，利用Vector NTI Advance 11.5软件进行引物构建，详细参数见表1。分别使用Vazyme FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit、HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for Qpcr、SYBR qPCR Master Mixc完成总RNA提取、cDNA合成和聚合酶链式反应（qPCR）。基因相对表达量分析采用2-ΔΔCt法进行相对定量计算。qPCR反应体系为10 μL，设置3个生物学重复和2个技术性重复，以确保数据的可靠性。
表1 qPCR 引物序列 |
| 名称 | 序列（5'—3'） | 登录号 |
|---|---|---|
| RGAF | ATCACTCTCTCTCCGACACGCTC | GU550519.1 |
| RGAR | GGACCACCTTCTCTCAACGCAA | |
| GA3F | GGATAAGAAGCGTTGGGAGAAGC | XM_013788321.3 |
| GA3R | TCAACATTCTCTTCCTCACCGTCT | |
| ARF2F | CTGGCACGCTATTTCAACTGGA | XM_013790234.2 |
| ARF2R | GCCTCTTCGCCTTCAAATCTCA | |
| IAA2F | TGTGAAAGTGAGTATGGACGGAGC | XM_013857323.3 |
| IAA2R | CCTTTGTATCCTTCTCTTTCGCTG | |
| ZEPF | GCATTGTCGGAAGTGAACCAGA | NM_001315888.1 |
| ZEPR | TGAGATAGGTCCCGTGTTCGC | |
| AAOF | GATTTAGGACAGGTGGAAGGAGC | XM_013887010.1 |
| AAOR | CACAATGAACCGAAGCCGC | |
| NCEDF | AGGAGACGAGAACAGAGCCGA | HQ260434 |
| NCEDR | ACAACACTCACACCTGCGTCG |
1.4 数据处理
采用DPS 7.05和 SPSS 26.0软件进行统计分析，使用Excel 2021软件进行数据可视化。
2 结果与分析
2.1 对油菜表型的影响
2.2 对油菜生理指标的影响
2.2.1 酶活性
如表3所示，与CK相比，GO处理提高了POD活性，处理间差异无统计学意义（P>0.05）；15 mg/L GO处理的幼苗SOD活性较CK下降，APX活性较CK提升，处理间差异均具有统计学意义（P<0.05）；25 mg/L GO处理的幼苗SOD和APX活性较CK提升，处理间差异均无统计学意义（P>0.05）。上述结果表明，GO处理会影响干旱胁迫下植株体内保护性酶活性，降低过氧化物对膜的损伤，进而增强植物抗逆能力。
表3 GO处理对干旱胁迫下甘蓝型油菜酶活性影响 |
| 处理 | CAT/（U/g） | POD/（U/g） | SOD/（U/g） | APX/[μmol/（g·min）] |
|---|---|---|---|---|
| CK | 243.24±31.57 a | 1 114.72±145.41 a | 82.91±6.12 a | 0.007 6±0.000 20 b |
| 15 mg/L GO | 239.92±21.18 a | 1 151.30±45.30 a | 58.11±0.25 b | 0.012 0±0.000 40 a |
| 25 mg/L GO | 265.36±4.27 a | 1 377.29±152.95 a | 100.87±9.33 a | 0.008 7±0.001 80 ab |
2.2.2 MDA、Pro及可溶性蛋白质含量
如表4所示，干旱胁迫条件下，GO 处理的植株MDA含量较CK明显降低（P<0.05）；25 mg/L GO 处理的植株Pro和可溶性蛋白含量较CK明显增加（P<0.05）。上述结果表明，GO对干旱胁迫下甘蓝型油菜叶片中MDA、Pro及可溶性蛋白的积累水平存在一定影响。
表4 GO处理对干旱胁迫下甘蓝型油菜MDA、Pro和可溶性蛋白含量的影响 (μg/g) |
| 处理 | MDA | Pro | 可溶性蛋白 |
|---|---|---|---|
| CK | 10.02±1.38 a | 51.32±0.83 b | 3 296.10±463.46 b |
| 15 mg/L GO | 6.87±0.18 b | 60.33±11.97 b | 2 877.87±483.53 b |
| 25 mg/L GO | 6.82±0.16 b | 623.51±132.49 a | 4 939.27±62.70 a |
2.2.3 内源激素含量
如表5所示，与CK相比，GO处理的植株GA水平均明显提高（P<0.05），表明GO处理后植株生长更旺盛，其中，25 mg/L GO处理的植株GA水平增加229.6 μg/g；15、25 mg/L GO处理的植株IAA水平较CK明显提高（P<0.05），增幅分别为29.0%和68.0%；15 mg/L GO处理的植株ABA水平较CK降低0.75 μg/g（P<0.05）。通常情况下，干旱胁迫条件下，IAA促进根系发育，高浓度ABA促进气孔关闭，本研究发现，GO处理可上调GA及IAA的生物合成水平、调控ABA代谢动态，表明GO处理可促进甘蓝型油菜根系发育和水分吸收，从而维持植株较好生长，增强植株的耐旱性。
表5 GO处理对干旱胁迫下甘蓝型油菜内源激素的影响 (μg/g) |
| 处理 | GA | IAA | ABA |
|---|---|---|---|
| CK | 256.94±11.62 c | 25.78±2.14 c | 4.83±0.140 a |
| 15 mg/L GO | 381.71±31.85 b | 33.25±2.45 b | 4.08±0.120 b |
| 25 mg/L GO | 486.54±23.96 a | 43.32±0.13 a | 4.65±0.076 a |
2.3 对油菜激素合成相关基因转录水平的影响
如图2所示，25 mg/L GO处理显著提高了GA信号基因RGA（1.69倍）、GA合成基因GA3（1.55倍）以及IAA2（1.30倍）表达，表明较高浓度的GO可能通过协同调控GA和IAA信号通路来影响植物生长发育。15 mg/L GO处理显著上调IAA信号基因ARF2（1.35倍）和ABA合成基因NCED的（1.36倍）表达，表明较低浓度的GO可能通过调节ABA合成来影响植物的逆境响应机制。这种差异反映了植物对不同浓度GO的响应机制，为理解纳米材料与植物激素信号网络的互作提供了新的实验依据。
3 结论与讨论
植物通过多种信号传导途径感应环境，从而在分子、细胞、生理和生化水平来响应逆境胁迫[12]。植物具有高效的胁迫信号识别机制及信号转导通路，将外界压力刺激转化为特异响应信号[13]。干旱胁迫初期，植物将Ca2+流作为植物胁迫响应信号，刺激植物产生活性氧（ROS）、一氧化氮合酶（NOS）等第二信使，从而调控胞内蛋白激酶活性，调节下游蛋白磷酸化修饰，通过磷酸化作用激活转录因子而调控相应基因表达。其中部分逆境响应基因促进ABA、乙烯（ET）及水杨酸（SA）等植物激素合成，形成正向逆境信号，调控渗透保护剂、膜稳定性代谢物、促细胞膜流动性物质合成，最大限度减少外界胁迫对植物生长发育的影响。干旱胁迫导致甘蓝型油菜须根生长缓慢、气孔导度降低、光合效率降低、抗氧化酶活性（POD、SOD、CAT、APX）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性增强，Pro、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质含量增加、电导率升高[14]。
石墨烯纳米材料相关研究集中于其理化性质及生物学特性，基于石墨烯纳米材料优异的机械特性、光学特性、化学特性及生物学特性，目前已经广泛应用于能源、医药、细胞和组织培养、电子、新材料以及环境保护等领域[15]。而对纳米材料在农业上的应用研究主要集中在其对植物生长发育的影响、病虫害防治及对环境保护的作用等方面。研究表明，碳纳米材料在植物种子萌发时期有正向作用，同时对植株的地上及地下部分发育也存在影响[6，16]。碳纳米材料影响洋葱等作物种子萌发及根系生长[17]。碳纳米材料可穿过植物种子的种皮，提高根组织的吸水率和运输效率，促进种子发芽及根、茎的生长，同时促进幼苗对水分的吸收，提高其对Fe2+、Ca2+等离子的吸收效率，进而提高其生物量[18]。Hu等[19]研究发现，氧化石墨烯处理能影响植物体内一些保护膜活性，影响植物体内物质代谢。García-sánchez等[20]研究发现，纳米材料处理会抑制拟南芥中与根毛发育相关基因的表达，上调ABA合成关键基因NCED及部分植物生长素响应因子的转录水平，并激活激素运输相关基因的表达，说明纳米材料会影响植物体内激素水平，且存在互作关系。
Mustafa等[23]研究表明，TiO2纳米材料处理维持了植物中IAA、GA和ABA的水平，从而提高小麦耐旱性。本试验中，25 mg/L GO处理显著提高GA信号基因RGA（1.69倍），GA合成基因GA3（1.55倍）以及IAA2（1.30倍）表达；GO处理后植株IAA和GA含量升高，而ABA含量降低，表明GO处理可促进甘蓝型油菜根系发育和对水分的吸收，从而维持植株的正常生长，以增强植株的耐旱性。本研究揭示了纳米材料通过多方面调控增强甘蓝型油菜的耐旱机制，为纳米材料在农业领域应用的后续研究提供了理论基础。