海岸潟湖作为陆海过渡带的关键生态系统，其独特的生态服务功能与研究价值备受关注。微生物作为物质循环的关键驱动者，其群落结构与功能丰度直接调控着相关物质的迁移、转化与积聚过程。
随着三代测序技术的发展与应用，高通量测序已广泛用于湿地生态系统的微生物研究[1]。容清等[2]应用宏基因组测序研究潟湖反硝化微生物活性，发现华南沿海潟湖反硝化微生物特征与沉积物反硝化速率受环境因子及营养盐调控。赵旺等[3]使用高通量测序技术分析了夏季美济礁潟湖海水细菌的群落结构组成，明确盐度是调控潟湖菌群结构的核心环境因子。本研究以品清湖潟湖湿地土壤和湿地外围周边土壤为研究对象，利用16S rRNA高通量测序方法对比探究了两种土壤生境下土壤细菌群落结构特征和功能差异，旨在明确潟湖湿地土壤不同于周边非湿地土壤的细菌群落结构特征，为维护品清湖潟湖生态系统功能稳定和挖掘潜在特异功能的菌种资源提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 研究区概况与样品采集
土壤样品于2024年11月采集至广东省汕尾市（22.75°—22.79° N，115.34°—115.44° E）。采集前清除土壤表面5 cm处的枯落物及杂质，采用5点采样法，用铲子采集0～20 cm 深度的土壤，将5个采样点的土壤混合均匀后作为1个复合样品。其中，湿地内采集3个样品，分别命名为SD1、SD2、SD3；湿地外围旱地采集3个对照样品，命名为HD1、HD2、HD3，共计6份土壤样品。所有样品采集后当天冷藏保存，送至上海美吉生物医药科技有限公司，依次开展DNA提取、PCR扩增及高通量测序。
1.2 DNA提取及高通量测序
土壤微生物群落总DNA采用E.Z.N.A.® soil DNA Kit （Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，采用NanoDrop2000（美国Thermo Scientific公司）超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度[4]。
以提取的总DNA为模板，采用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR反应体系（20 μL）如下：2×ProTaq缓冲液10 μL，上、下游引物（5 umol/L）各0.8 μL，模板DNA（10 ng/uL）2 μL，其余用ddH2O补足。扩增程序为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共27个循环；最后72 ℃稳定延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶回收后，QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）进行检测定量[5-6]。
纯化后的PCR产物采用NEXTFLEX ® Rapid DNA-Seq Kit进行建库，利用Illumina Nextseq 2000平台完成测序（上海美吉生物医药科技有限公司），测序原始数据已上传至NCBI SRA数据库（序列号：PRJNA1344907）。
1.3 数据分析
使用fastp 0.19.6软件完成双端原始测序序列质控，借助FLASH 1.2.11软件实现序列拼接。运用UPARSE v7.1软件，以97%序列相似度为标准开展操作分类单元（OTU）聚类分析，并去除嵌合体序列。将所有样本序列统一抽平至20 000条，抽平后各样本平均序列覆盖度可达99.99%。
依托RDP classifier 2.11软件，比对Silva 16S rRNA基因v138数据库完成OTU物种注释，设置置信度阈值为70%，并在各分类层级统计微生物群落组成特征[7]。本研究所有生物信息学分析均于美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com/）完成。利用mothur软件计算Chao1、Shannon-Wiener等Alpha多样性指数；基于Bray-Curtis距离开展PCoA分析，解析样本间微生物群落结构差异；通过LEfSe分析筛选组间自门至属水平的差异优势菌群；采用PICRUSt2 2.2.0软件完成菌群功能基因预测。
2 结果与分析
2.1 测序总数据统计及多样性分析
表1 测序数据及Alpha多样性指数统计 |
| 样本 | Shannon-Wiener | Ace | Chao1 | Simpson | 测序深度指数 |
|---|---|---|---|---|---|
| HD1 | 6.78 | 3 452.15 | 3 405.39 | 0.004 70 | 0.999 9 |
| HD2 | 6.16 | 2 438.56 | 2 430.93 | 0.006 97 | 0.999 9 |
| HD3 | 5.221 | 1 726.24 | 1 716.59 | 0.021 50 | 0.999 9 |
| SD1 | 6.855 | 3 881.05 | 3 759.88 | 0.004 01 | 0.999 9 |
| SD2 | 6.935 | 3 931.83 | 3 832.95 | 0.003 36 | 0.999 9 |
| SD3 | 6.646 | 4 044.76 | 3 911.46 | 0.008 46 | 0.999 9 |
2.2 研究区湿地土壤细菌群落组成
图2A为不同土地利用方式下门水平上相对丰度大于1.0%的土壤细菌类群。旱地土壤优势菌群主要包括变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes），累计相对丰度为83.4%～93.1%。湿地土壤中优势类群以变形菌门和脱硫杆菌门（Desulfobacterota）为主、辅以拟杆菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、弯曲菌门（Campylobacterota）和厚壁菌门，上述菌群合计占总序列的86.7%～88.8%。相较于旱地土壤，湿地土壤中变形菌门、酸杆菌门、放线菌门、蓝藻门、拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度依次下降18.2%、46.8%、70.0%、98.7%、40.5%和34.8%；脱硫杆菌门相对丰度升至15.95%～17.82%，该门类在旱地土壤中占比不到1%。绿弯菌门和弯曲菌门相对丰度分别较旱地高48.5%、49.7%。属水平细菌群落组成特征见图2B，湿地土壤优势菌属为Woeseia、Sulfurovum和Sva0081 sediment_group，此类菌属在旱地土壤中未检出；旱地土壤优势菌属为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas），其在湿地土壤中占比低于1%。此外，在湿地土壤和旱地土壤中还检测到了大量的unclassified和norank细菌，其相对丰度在湿地土壤中高于周边旱地土壤，在湿地土壤中的Others菌属占74.26%，低于周边旱地土壤的84.71%。
2.3 研究区湿地土壤细菌群落的差异
基于Bray-Curtis距离矩阵开展PCoA分析，结果如图3所示。主成分（PC1）和主成分（PC2）共解释了80.98%的微生物结构差异性，贡献率分别是64.07%和16.91%。湿地和旱地样本相距较远，相似区域内的样本有集聚趋势，湿地样品相较于旱地更为聚集，这表明研究区高盐厌氧水环境对土壤细菌群落结构具有较大的影响。
采用LEfSe分析筛选两组生境间差异显著菌群（LDA>4.0），结果见图4。门水平上，湿地土壤脱硫杆菌门、绿弯菌门和弯曲菌门相对丰度明显高于旱地土壤（P<0.05）；旱地土壤变形菌门、蓝藻门、拟杆菌门和放线菌门丰度则显著更高（P<0.05）。属水平差异进一步表明，湿地土壤显著富集弯曲菌门的Sulfurovum、脱硫杆菌门的Sva0081 sediment_group和变形菌门的Woesela（P<0.05）；旱地土壤则以节杆菌属（Arthrobacter）、拟杆菌门的黄褐杆菌属（Flavisolibacter）、变形菌门的枝杆菌属（Ramlibacter）和鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）为主要差异优势菌属（P<0.05）。
2.4 研究区高盐缺氧环境作用下的细菌群落功能差异
运用PICRUSt2软件结合KEGG数据库，对研究区湿地土壤细菌群落开展功能代谢预测，共划分得到新陈代谢（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic information processing）、环境信息处理（Environmental information processing）、细胞过程（Cellular processes）、人类疾病（Human diseases）及有机系统（0rganismal systems）六大一级代谢通路（图5）。其中，新陈代谢通路占比最高，在76.29%～77.83%，有机系统通路占比最低，在1.78%～2.10%。方差分析显示，相较于旱地土壤，研究区湿地土壤细菌群落中遗传信息处理、细胞过程两类一级功能通路占比显著提升（P<0.05），人类疾病相关功能通路占比则显著下降。二级功能层面共注释得到46个子功能通路，以全局概览通路（Global and overview maps）占比最高，在39.22%～40.40%。组间差异分析表明，湿地土壤细菌在环境适应（Environmental adaptation）、聚糖生物合成和代谢（Glycan biosynthesis and metabolism）、折叠分拣降解（Folding，sorting and degradation）、复制修复（Replication and repair）、翻译（Translation）及辅助因子和维生素代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）等功能上占比显著增加，物质依赖（Substance dependence）、其他氨基酸代谢（Metabolism of other amino acids）及外源性物质的生物降解和代谢（Xenobiotics biodegradation and metabolism）功能占比显著低于旱地土壤，其余二级功能所占比例无明显变化。
3 结论与讨论
3.1 高盐缺氧环境作用下湿地细菌群落多样性的变化
为了探明研究区湿地土壤微生物多样性，本研究选取湿地周边土壤为对照，所选取的湿地外围周边土壤属于陆生生态系统，与湿地土壤生态环境差异较大。结果表明，研究区湿地土壤的Shannon-Wiener和Chao1指数均高于旱地土壤，相关研究证实，该差异主要源于研究区半封闭的地理位置与高盐生境特征[8]，水体交换能力弱，促使营养物质和元素富集，从而蕴含了更丰富的微生物资源，因此具有更高的生物多样性。
3.2 高盐缺氧环境作用下湿地细菌菌群结构的变化
研究区湿地土壤优势菌属为Sulfurovum、Sva0081 sediment group和Woesela。其中，Woesela功能尚未明确，现有研究证实其与湿地多环芳烃污染及硫循环相关[13]；Sulfurovum与Sva0081 sediment group可参与并驱动湿地硫循环过程。湿地土壤unclassified和norank类群占比较高，表明该特殊生境富集大量未培养、未分类厌氧微生物，群落功能集中于优势菌群；旱地土壤Others类群占比更高，菌群分布更为分散，受人为干扰、根系分泌物波动等因素影响，形成了功能冗余的群落结构。
3.3 高盐缺氧环境作用下湿地细菌菌群功能的变化
微生物群落结构与生态功能密切相关，结构变化会直接造成功能差异。PICRUSt2因操作简便、成本低、结果可靠，已广泛用于不同生境微生物功能解析。本研究一级通路分析显示，新陈代谢占比最高，是湿地土壤细菌生命活动的核心。二级通路对比发现，湿地土壤细菌在转录、翻译、复制修复、环境适应、聚糖代谢等功能上丰度更高。转录、翻译与复制修复能力更强，反映其氨基酸、蛋白质合成水平优于旱地菌群，推测是细菌合成渗透调节物质以适应高盐环境所致[14]。此外，湿地丰富的有机质与碳源，可助力聚糖、辅酶及维生素代谢，改善细菌生存环境。
3.4 结论
本研究对比分析了湿地与旱地土壤细菌群落结构，发现湿地细菌群落丰富度、多样性更高。物种注释共鉴定出细菌70个门，其中湿地土壤以脱硫杆菌门、绿弯菌门、弯曲菌门为优势菌门，优势菌属主要包括Sulfurovum、Sva0081 sediment group和Woesela等；旱地土壤优势类群则以变形菌门、拟杆菌门为主，鞘氨醇单胞菌属、节杆菌属、黄褐杆菌属和枝杆菌属为主要优势菌属。PCoA分析结果表明，研究区高盐低氧的特殊生境是造成两类生境细菌群落结构分化的重要因素。PICRUS2功能预测结果显示，研究区特殊生境可显著激活土壤细菌转录调控、环境适应、聚糖生物合成代谢、蛋白折叠分拣降解、遗传物质复制修复、翻译及辅助因子与维生素代谢等生理通路。本研究成果可为高盐湖泊微生物研究提供参考。后续研究可开展古菌、真菌相关分析，结合宏基因组与菌株分离技术挖掘功能菌群，为湿地生态保护与水环境稳定提供理论依据。