石榴为千屈菜科的一种落叶灌木。该植物拥有独特的药用成分，能够有效地收敛肠胃、迅速止血，同时还能驱除体内的寄生虫。石榴皮也称石榴壳、安石榴酸实壳，味酸、涩，性温，小毒，被广泛应用于医学实践中。石榴皮鲜重约占果实的40%，其外皮部分富含诸多营养和生物活性成分，如纤维素、类黄酮物质、不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素C、多酚类化合物以及多种矿物质等。膳食纤维在石榴皮内的含量较为丰富，其不仅在调节血糖、促进肠道顺畅方面有着显著效果，还展现出消炎、抗氧化和抗病毒等多种药理活性。
膳食纤维是维持人体健康以及促进生长发育的不可或缺的营养素之一[1]。杜艳等[2]、王忠合[3]以石榴皮为原材料，通过一系列的单因素试验，并结合正交试验优化，探究石榴皮中水不溶性膳食纤维（IDF）的最佳提取工艺，实现高效优质提取，以更好地发挥石榴皮中膳食纤维的潜在价值。
复合酶解法是一种利用特定酶进行相应的化学反应去除一些特定结构的方法。该方法通过使用不同的酶来分解特定的生物分子，以达到改变物质性质或提取特定成分的目的。酶是一类专一性强、效率高的催化剂，如纤维素酶能降解纤维素，蛋白酶能降解蛋白质等。通过调节酶解条件，如酶解时间、酶解温度和多种酶的配比等，可以优化酶解过程，提高特定物质的溶出比率，进而提高产出率。本试验采用酶解法从石榴皮的膳食纤维中分离出IDF，通过单因素和正交试验方法探究各类酶添加量、酶解温度和水浴时间对IDF提取的影响，并筛选出最佳配比，为后续膳食纤维提取及合理利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试材料
市售新鲜石榴、果胶酶（酶活力50 000 U/g）、木瓜蛋白酶（酶活力10 000 U/mg）、纤维素酶（效价2 000 U/g），盐酸、氢氧化钠均为分析纯。
数显式电热恒温水浴锅（HWS-24型）；低速自动平衡离心机（TD25型）；电热恒温鼓风干燥箱（101FA-0型）；高速多功能粉碎机（XA-1型）；电子分析天平（AR124CN型）。
1.2 试验方法
工艺流程：石榴皮→烘干→粉碎→过100目筛→灭菌→酶解→酶灭活10 min→过滤、离心10 min（4 000 r/min）→30 ℃烘干→提取石榴皮不溶性膳食纤维。
1.2.1 石榴皮预处理
选取新鲜无腐烂的石榴，将其剥皮后清水冲洗5 min，并轻搓其表面；而后剪切成9 cm2左右的小块；在40～50 ℃电热恒温鼓风干燥箱中脱水干燥至恒重；用粉碎机粉碎，随后过100目筛除去未被彻底粉碎的较大颗粒[2]。
1.2.2 恒温酶解
将制作好的石榴皮粉末与蒸馏水按1:25（m:V)的料液比进行混合，并加入一定比例的果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶，同时放入石榴皮粉末溶液中，在恒温条件下进行酶解反应，均匀搅拌反应物以保证反应彻底[4]。
1.2.3 酶灭活
使用果胶酶、纤维素酶等复合酶进行酶解试验后，立即放入沸水中加热10 min，使酶完全失活。
1.2.4 离心
将上述溶液冷却至室温，随后使用离心机以4 000 r/min对溶液进行充分的离心处理，持续10 min。
1.2.5 干燥
将离心管内的沉淀物质在恒温箱中进行烘干，烘干温度30 ℃，避免IDF被高温破坏[5]。
1.3 石榴皮中IDF提取试验设计
1.3.1 单因素试验
表1 单因素试验基础条件 |
| 因素 | 不变量 |
|---|---|
| 果胶酶添加量/% | 料液比，1:25（m:V）；温度，60 ℃；时间，80 min；木瓜蛋白酶，1.25%；纤维素酶，0.50% |
| 木瓜蛋白酶添加量/% | 料液比，1:25（m:V）；温度，60 ℃；时间，80 min；果胶酶，1.00%；纤维素酶，0.50% |
| 纤维素酶添加量/% | 料液比，1:25（m:V）；温度，60 ℃；时间，80 min；果胶酶，1.00%；木瓜蛋白酶，1.25% |
| 酶解温度/℃ | 料液比，1:25（m:V）；时间，80 min；果胶酶，1.00%；木瓜蛋白酶，1.25%；纤维素酶，0.50% |
| 水浴时间/min | 料液比，1:25（m:V）；温度，60 ℃；果胶酶1.00%；木瓜蛋白酶，1.25%；纤维素酶，0.50% |
表2 石榴皮中IDF单因素试验水平 |
| 水平 | 因素 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 果胶酶添加量/% | 木瓜蛋白酶添加量/% | 纤维素酶添加量/% | 水浴温度/℃ | 酶解时间/min | |
| 1 | 0.25 | 0.75 | 0.25 | 40 | 40 |
| 2 | 0.50 | 1.00 | 0.50 | 50 | 60 |
| 3 | 0.75 | 1.25 | 0.75 | 60 | 80 |
| 4 | 1.00 | 1.50 | 1.00 | 70 | 100 |
| 5 | 1.25 | 1.75 | 1.25 | 80 | 120 |
1.3.2 IDF正交试验
单因素试验结果显示纤维素酶对IDF的得率影响不明显，因此选择果胶酶添加量、木瓜蛋白酶添加量、酶解温度及水浴时间等对石榴皮IDF得率影响较大的因素，并在纤维素酶添加量0.75%的情况下，进行L9（34）正交优化试验，以确定石榴皮中IDF提取的最佳工艺条件。石榴皮IDF得率的正交试验设计见表3。
表 3 正交试验因素与水平设计 |
| 水平 | 因素 | |||
|---|---|---|---|---|
| A果胶酶 添加量/% | B木瓜蛋白 酶添加量/% | C酶解 温度/℃ | D酶解 时间/min | |
| 1 | 0.75 | 1.00 | 40 | 40 |
| 2 | 1.00 | 1.25 | 50 | 60 |
| 3 | 1.25 | 1.50 | 60 | 80 |
1.4 测定项目及方法
1.4.1 IDF得率
根据GB 5009.88—2023《食品中膳食纤维的测定》中酶重量法对原料的IDF含量进行测定。石榴皮中IDF得率的计算如式（1） 。
1.4.2 石榴皮中IDF持水力
参考文献[7]的方法测定石榴皮中IDF持水力。称取样品1.000 g于烧杯中，放入蒸馏水50 mL，于25 ℃浸泡24 h，3 000 r/min离心15 min，去除上清液，称样品湿质量m 1，于105 ℃下烘干至恒重，称样品的干质量m 0。持水率计算如式（2） 。
1.4.3 石榴皮中IDF溶胀性的测定
称取样品1.000 g于10 mL量筒中，微振荡，读取干品体积V 0，再转移于100 mL量筒中，放入蒸馏水50 mL，25 ℃下振荡24 h，测量体积V 1。溶胀性计算如式（3） 。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 果胶酶
由图1可知，果胶酶加入量控制在一定范围内，IDF得率随其添加量的增加呈现先上升后下降的趋势，在添加量为1.00%时，石榴皮IDF得率最高，为41.64%，而后得率下降。因此，本试验条件下，果胶酶的最佳添加量为1.00%。
2.1.2 木瓜蛋白酶
2.1.3 纤维素酶
2.1.4 酶解温度
由图4可知，随着温度逐步升高，石榴皮IDF得率呈先升高后降低的趋势。当温度达50 ℃时，石榴皮IDF得率达到最大值，为42.14%；而后随着酶解温度持续升高，石榴皮IDF的得率缓慢降低；至70 ℃时，IDF得率变化较小，原因可能是酶在较高温度时空间结构发生改变而失活。因此，本试验条件下，最佳酶解温度为50 ℃。
2.1.5 水浴时间
2.2 正交优化试验
表 4 正交试验方案及石榴皮IDF得率 |
| 试验编号 | A | B | C | D | IDF得率/% |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 26.46 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 39.38 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 35.00 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 47.86 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 42.05 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 41.72 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 40.41 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 32.81 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 35.09 |
| K 1 | 100.84 | 114.73 | 100.99 | 103.60 | |
| K 2 | 131.63 | 114.24 | 122.33 | 121.51 | |
| K 3 | 108.31 | 111.81 | 117.46 | 115.67 | |
| k 1 | 33.61 | 38.24 | 33.66 | 34.53 | |
| k 2 | 43.88 | 38.08 | 40.78 | 40.50 | |
| k 3 | 36.10 | 37.27 | 39.15 | 38.56 | |
| R | 10.26 | 0.97 | 7.11 | 5.97 |
表5 各因素对石榴皮IDF得率的方差分析 |
| 变异来源 | 平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | P值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| A | 171.961 | 2 | 85.980 | 105.487 | 0.009 | ** |
| B | 1.630 | 2 | 0.815 | 1.000 | 0.500 | |
| C | 83.375 | 2 | 41.687 | 51.145 | 0.019 | * |
| D | 55.618 | 2 | 27.809 | 34.118 | 0.028 | * |
| 误差e | 1.630 | 2 | 0.815 |
|
2.3 最佳工艺组合验证试验
基于正交优化试验结果的条件进行重复试验，最终得出石榴皮IDF得率为47.93%。在最佳工艺组合作用下，所得IDF的持水力、溶胀性分别为3.43 g/g、3.45 mL/g。
3 结论与讨论
单因素试验发现，木瓜蛋白酶对IDF得率影响较大；果胶酶和纤维素酶次之。通过正交试验优化提取工艺流程，确定了最佳的酶浓度、酶解温度和水浴时间的组合。在料液比1:25（m:V），纤维素酶添加量0.75%条件下，果胶酶和木瓜蛋白酶添加量均为1.00%，即复合酶配比1:1，酶解水浴适宜时间60 min，酶解水浴适宜温度50 ℃。在此条件下，IDF得率达到了较高水平，为47.93%，较杜艳等[2]的酶法提取IDF得率31.87%和段振[10]的碱法提取IDF得率30.42%高；且工艺环保高效，产品优质精细。本试验提取石榴皮膳食纤维为粗提取物，所得产品呈黄褐色，需进一步脱色，后续试验可在此基础上增添对粗提物的检测或碱浸法或乙酸乙酯浸泡用以提纯膳食纤维。
膳食纤维市场有良好的发展前景。本研究结果为石榴皮膳食纤维的高效提取提供了参考，优化后的提取工艺流程具有较高的稳定性和可操作性，可在工业生产中广泛应用，提高了石榴皮的利用率和经济效益。未来，石榴皮膳食纤维可在食品、医药和保健品行业发挥更大作用，尤其是在开发功能性食品、营养补充剂以及低糖或高纤维饮品方面。与市面上其他膳食纤维制品相比，石榴皮膳食纤维不仅具备独特的抗氧化特性，还可通过环保的提取工艺降低生产成本，增强其市场竞争力。